Экстракты Sclerocarya birrea (US8445040B2)

Настоящее изобретение в целом относится к водорастворимым экстрактам, полученным из Склерокария бирреа Фрукты и их использование.

Марула ( Sclerocarya birrea, Семейство: Anacardiaceae) — листопадное дерево среднего и крупного размера с прямым стволом и округлой кроной. Сегодня это растение используется в качестве источника пищи так же, как и в древние времена. Плоды марулы съедобны, их обычно едят сырыми или перерабатывают в различные пищевые продукты, такие как желе, а также варят из них алкогольное пиво, известное среди народа вхавенда как мукумби.

Медицинское применение марулы включает использование коры и листьев для лечения заболеваний, связанных с бактериями, и диабета [1,2], а также диареи, как описано в австралийской патентной публикации №. 2000/29790 [3].

Международная публикация №. В WO 03/092634 [4] описано использование масла марулы в местных препаратах для ингибирования образования рубцовой ткани на коже.

Было показано, что плоды марулы обладают повышенной общей антиоксидантной активностью [5], способностью ингибировать перекисное окисление фосфолипидов и обладают активностью по удалению супероксидного анионного радикала [6]. Международная публикация №. В WO 06/097806 [7] раскрывается, что различные части растения марулы, такие как кора, листья, плоды, корни и семена, содержат гидрофобные антиоксиданты, которые можно получить из растения путем мацерации и/или экстракции.

Публикации

Хотя сообщается, что плоды марулы богаты антиоксидантами, до сих пор не было сообщений о получении и использовании экстрактов плодов марулы для лечения таких заболеваний и расстройств, как атеросклероз и нейродегенеративные заболевания.

Описанные здесь неожиданные результаты свидетельствуют о том, что экстракты, полученные из сока марулы, не только стабильны в течение длительного времени, но и, что еще важнее, обладают терапевтическими преимуществами, отличными, а в некоторых случаях и превосходящими те, которые демонстрирует необработанный сок марулы. Было показано, что экстракты по изобретению благоприятно влияют на липиды крови, что подтверждается снижением уровня ЛПНП в сыворотке, повышением уровня ЛПВП в сыворотке и ослаблением окислительного стресса в сыворотке; Экстракты продемонстрировали эффективность в лечении повреждений, вызванных окислительным стрессом, атеросклероза, нейродегенерации и связанных с ними расстройств.

Экстракты сока марулы по настоящему изобретению также эффективны в предотвращении нейродегенерации, о чем свидетельствует их защитное воздействие на нейронные клетки, подверженные повреждению свободными радикалами.

Настоящее изобретение также раскрывает использование экстрактов сока марулы в качестве антиоксидантов для использования в самых разных целях, например, в пищевых добавках для создания, например, антиатерогенного эффекта у здоровых и нездоровых субъектов (людей и животных), а также в качестве средств для лечения или профилактики нейродегенеративных заболеваний.

Таким образом, в одном из аспектов настоящего изобретения предлагается экстракт, полученный из плодов марулы, за исключением семян, причем указанный экстракт получают с помощью процесса, включающего подвергание сока, собранного из плодов марулы, экстракции одним или несколькими водными растворителями, органическими растворителями и их смесью, т. е. для получения таким образом из сока марулы экстракта, имеющего желаемые биологические преимущества.

Сок марулы, полученный из плодов марулы, перед экстракцией можно профильтровать, чтобы удалить остатки плодов, такие как остатки семян и другие нерастворимые вещества. Фильтрация может осуществляться с использованием любого известного в данной области метода фильтрации напитков, включая, помимо прочего, фильтрацию через диатомовую землю (DE) и мембранную фильтрацию.

В некоторых вариантах сок марулы, полученный из плодов марулы, пастеризуют перед экстракцией, чтобы замедлить рост микроорганизмов в соке за счет уменьшения количества жизнеспособных патогенов в нем. Обычно пастеризация проводилась путем воздействия на сок температур ниже температуры кипения. В некоторых вариантах реализации пастеризация достигается одним или несколькими другими методами пастеризации, известными в данной области, например, контролируемыми национальными агентствами по безопасности пищевых продуктов (такими как Министерство сельского хозяйства США в США и Агентство по стандартам на пищевые продукты в Великобритании). Некоторые неограничивающие примеры включают высокотемпературную/кратковременную пастеризацию (HTST), пастеризацию с увеличенным сроком хранения (ESL), сверхвысокотемпературную пастеризацию (UHT или ультрапастеризация), а также периодическую или ванную пастеризацию.

Термин «экстракт», используемый в настоящем документе, относится к водорастворимому продукту, полученному из любой части плода марулы или любой части, полученной из него, за исключением семян, но включая один или несколько из следующих процессов: мезокарпий, эндокарпий, кожура (толстая внешняя оболочка) и/или кожица (экзокарпий), с использованием метода, выбранного из отжима, абсорбции, мацерации, лиофилизации, дистилляции и любой комбинации двух или более из этих процессов.

Экстрагированные вещества, по отдельности или в комбинации, могут быть сформированы в любую желаемую форму, включая водный раствор, твердое вещество, такое как сухой порошок, гранулы или пеллеты, концентрат, например, полужидкость, имеющую сиропообразную консистенцию, которая может быть получена путем выпаривания всего или почти всего жидкого содержимого экстракта, или любую другую форму. В целом методы извлечения материала могут различаться. mutatis mutandis в зависимости от возраста плода марулы, подтипа, сезона сбора урожая, региона произрастания, извлекаемых веществ, их стабильности и других факторов, которые известны специалисту в данной области.

В некоторых вариантах реализации экстракт по настоящему изобретению получают путем контактирования сока марулы с водным раствором для извлечения из него одного или нескольких ингредиентов или их комбинации. «Водный раствор» может быть в самом общем смысле водой (в некоторых вариантах реализации вода с различной концентрацией природных минералов) или дистиллированной или иным образом очищенной (дистиллированной или очищенной любым другим способом) водой, водным солевым раствором, содержащим одну или несколько солей или смесью воды с одним или несколькими смешивающимися с водой полярными растворителями, например, _C1 - _C4. спирты и кетоны.

В некоторых вариантах реализации водный растворитель представляет собой смесь воды и по крайней мере одного спирта. В некоторых дополнительных вариантах реализации водный растворитель представляет собой смесь воды и этанола, где соотношение вода:этанол составляет 1:1, 1:2. . . 1:5. . . 1:10. . . 1:100. . . 1:1000. . . и т. д., соответственно, или 2:1, 3:1. . . 5:1. . . 10:1. . . 100:1. . . 1000:1 и т.д. соответственно. Любые другие промежуточные соотношения также включены.

В качестве альтернативы экстракции можно использовать органический растворитель отдельно или в сочетании с другим подобным растворителем. В некоторых вариантах осуществления процесс экстракции представляет собой многоступенчатый процесс, при котором плод марулы (сок) сначала контактирует с одним растворителем, а затем с другим растворителем, чтобы максимизировать выход или обогатить экстракт одним или несколькими желаемыми компонентами.

Обычно органическим растворителем является по крайней мере один спирт, такой как метанол, этанол и изопропиловый спирт, или кетон, такой как ацетон. При использовании этанола его можно использовать в виде водно-этанольного раствора, например, с концентрацией этанола от 40 до 60%. Аналогичные растворы можно использовать и с другими водосмешиваемыми органическими растворителями. Экстракт, полученный из следующего спиртового экстракта, в настоящем документе обозначен как экстракт I.

В контексте настоящего изобретения следует понимать, что этанольная экстракция или любая другая экстракция, описанная в настоящем документе, может проводиться при любой удобной температуре. Специалистам в данной области будет очевидно, что более эффективная экстракция будет происходить, если сок перемешивать, например, путем помешивания или встряхивания, и/или если смесь нагревать до температуры выше комнатной (выше 25–27 °C). Также можно использовать более низкие температуры экстракции, например, ниже комнатной. В некоторых вариантах процесс экстракции проводят при комнатной температуре или при температуре от 25 до 30°С.

В контексте настоящего изобретения следует также понимать, что экстракция может осуществляться в течение любого удобного периода времени.

Специалист в данной области также поймет, что процесс получения экстракта по изобретению может включать мацерацию плода марулы для получения более мелких кусочков целого плода, из которых экстракты могут быть получены одним или несколькими другими методами экстракции, такими как дистилляция. Альтернативно экстракт можно получить путем отжима, а именно выжимания сока из плодов.

Таким образом, в некоторых вариантах реализации перед контактом сока с одним или несколькими растворителями, как описано, фрукт, т. е. целый фрукт, за исключением семян или любой его части, может быть предварительно обработан путем мацерации, отжима или любого другого процесса.

Сок, полученный из плодов марулы, можно хранить в течение длительного времени перед экстракцией или предварительной обработкой, например, сушкой. Хранение может осуществляться при любой температуре и условиях, при которых сохраняется свежесть сока и предотвращается или сводится к минимуму его ухудшение. Такие температуры могут быть выше или ниже комнатной температуры. В некоторых вариантах сок можно хранить в холодильнике в течение нескольких недель или в морозильнике в течение нескольких лет. При использовании замораживания сока процесс может дополнительно включать этап размораживания сока перед извлечением или обработкой.

Сушка сока может быть достигнута путем нагревания жидкого сока под вакуумом или при атмосферном давлении при предварительно установленной температуре, которая может быть комнатной или выше температуры окружающей среды, одной партией или меньшими порциями, чтобы контролировать содержание влаги в экстракте. В неограничивающем примере, раскрытом в настоящем документе, сушка достигается путем выливания сока на поверхность, такую ​​как поднос, в некоторых случаях покрытый фольгой (например, алюминиевой фольгой) для равномерного нагрева сока и получения по существу однородного слоя высушенного экстракта марулы.

Полученный в результате сушки влажный концентрат (сироп) имеет цвет от желтоватого до темно-коричневого в зависимости от концентрации и типа экстракта. Высушенный материал легко измельчается и имеет цвет от ярко-золотистого до темно-коричневого в зависимости от типа экстракта. Высушенное вещество растворимо в воде.

Полученный впоследствии экстракт марулы содержит различное количество летучих веществ, количество которых зависит от продолжительности периода сушки и используемой температуры. Не желая ограничиваться теорией, после удаления летучих компонентов концентрат, а именно в некоторых вариантах осуществления порошкообразный экстракт, содержит по сравнению с цельным фруктовым соком более высокую концентрацию активных компонентов, присутствие и сочетание которых обеспечивает высокую активность, которая не наблюдается в цельном фрукте и которая продемонстрирована в настоящем документе.

Таким образом, экстракт получают с помощью процесса, включающего контакт сока марулы с водным растворителем, как определено, для получения суспензии, из которой можно отделить жидкий экстракт.

В некоторых вариантах осуществления процесс включает:

В некоторых вариантах осуществления собранный сок сушат или предварительно обрабатывают, как описано, перед экстракцией.

В дополнительных вариантах осуществления разделение жидкого экстракта на этапе (iii) может осуществляться путем центрифугирования суспензии, полученной на этапе (ii), для отделения жидкого экстракта в виде супернатанта от твердой массы.

В некоторых дополнительных вариантах осуществления процесс включает:

В дополнительных вариантах осуществления процесс включает:

В некоторых других вариантах осуществления процесс включает:

Следует отметить, что разделение жидкого экстракта можно повторять более одного раза, со вторым количеством того же или другого растворителя, а супернатанты, полученные на каждом этапе, можно объединять и дополнительно обрабатывать для выделения, концентрирования или дальнейшей переработки экстракта. Таким образом, можно объединить два или более супернатанта и удалить растворитель и/или часть воды, например, используя любой один метод удаления растворителя.

Если исходный фруктовый материал включает твердое вещество или если плод марулы был переработан в сушеный или полусухой порошок или гранулированную форму, экстракт может быть разделен по крайней мере на твердую фазу и водную фазу, причем каждая фаза имеет биологическую активность, как описано в настоящем документе.

Экстракт изобретения, полученный с использованием одного или нескольких процессов, описанных в настоящем документе, может характеризоваться одним или несколькими из следующих признаков:

Таким образом, изобретение также обеспечивает получение экстракта марулы, характеризующегося антиоксидантной способностью FRAP не менее 1000 и 1500 мг эквивалентов витамина С на 100 мл. Для сравнения, показатель FRAP, измеренный для необработанного сока марулы, составляет от 260 до 600 мг витамина С на 100 мл. Другими словами, FRAP-емкость экстракта согласно изобретению в 2–3 раза превышает активность, наблюдаемую в исходном необработанном соке.

В некоторых вариантах реализации экстракт, имеющий указанную выше емкость FRAP, представляет собой экстракт I.

Настоящее изобретение также обеспечивает экстракт, содержащий обедненную полифенольную фракцию, причем указанный экстракт обозначен здесь как экстракт II. Полифенольная фракция, в данном случае экстракт III, может быть отделена от сока марулы, например, с помощью хроматографии сока марулы для получения экстракта II (обедненного) и экстракта III (отделенной фенольной фракции). В некоторых вариантах осуществления истощение полифенольной фракции достигается с помощью процесса, включающего фильтрацию сока марулы, например, пропусканием сока через один или несколько слоев марли (различных сортов, например, от рыхлого до сверхтонкого плетения, используемого в зависимости от качества и количества сока), необязательного центрифугирования отфильтрованного сока для удаления остатков фруктов, нанесения прозрачного сока на хроматографическую колонку, например, колоночную хроматографию с использованием колонок, заполненных ионообменными и адсорбционными смолами Sepabeads или силикагелем или смолами, связанными с _C18, для гидрофобного взаимодействия и обращенно-фазовой хроматографии, сбора фракций и объединения фракций с одинаковым общим содержанием растворимых твердых веществ (TSS).

В некоторых вариантах осуществления фракция полифенолов может быть собрана из среды, используемой для хроматографии, например, из шариков колонки, путем смешивания среды, например, шариков, со спиртовым раствором (этанол, метанол и т. д.). Затем спиртовые фракции можно объединить и выпарить досуха.

Согласно некоторым вариантам реализации, для получения экстракта с повышенным соотношением полифенолов и витамина С полифенольная фракция (т. е. экстракт III) может быть отделена от сока, а затем добавлена ​​к обедненной полифенолами фракции (т. е. экстракту II). В некоторых других вариантах экстракт II объединяется с экстрактом I.

В некоторых вариантах реализации экстракт II характеризуется антиоксидантной способностью FRAP не менее 250–500 мг эквивалентов витамина С на 100 мл.

В настоящем документе термин «полифенолы» относится к группе веществ, характеризующихся наличием более одной фенольной единицы или строительного блока на молекулу. Полифенолы обычно делятся на гидролизуемые танины (эфиры галловой кислоты глюкозы и других сахаров) и фенилпропаноиды, такие как лигнины, флавоноиды и конденсированные танины. В некоторых вариантах реализации полифенолы, полученные из сока макулы, включают гидролизуемые танины, катехины и гидроксикоричные кислоты и/или их производные.

В другом своем аспекте настоящее изобретение предусматривает использование по меньшей мере одного экстракта изобретения для приготовления композиции.

В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой фармацевтическую композицию.

В дополнительных вариантах реализации экстракт представляет собой активный ингредиент, присутствующий в композиции вместе с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.

Выбор носителя будет частично определяться конкретным экстрактом, а также конкретным методом, используемым для введения входящей в его состав композиции. Соответственно, существует широкий спектр подходящих рецептур фармацевтической композиции настоящего изобретения. Следующие составы для перорального, аэрозольного, парентерального, подкожного, внутривенного, внутримышечного, внутрибрюшинного, ректального и вагинального введения являются всего лишь примерными и никоим образом не ограничиваются.

Составы, подходящие для перорального применения, могут состоять из (а) жидких растворов, таких как эффективное количество экстракта, растворенного в разбавителях, таких как вода, физиологический раствор или апельсиновый сок; (б) капсулы, саше, таблетки, пастилки и леденцы, каждая из которых содержит определенное количество экстракта в виде твердых веществ или гранул; (в) порошки; (d) суспензии в соответствующей жидкости; и (e) подходящие эмульсии. Жидкие составы могут включать разбавители, такие как вода и спирты, например, этанол, бензиловый спирт и полиэтиленовые спирты, с добавлением фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, суспендирующего агента или эмульгатора или без них. Капсулы могут быть обычного твердого или мягкого желатинового типа, содержащие, например, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества и инертные наполнители, такие как лактоза, сахароза, фосфат кальция и кукурузный крахмал. Таблетированные формы могут включать один или несколько из следующих компонентов: лактоза, сахароза, маннит, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота, микрокристаллическая целлюлоза, аравийская камедь, желатин, гуаровая камедь, коллоидный диоксид кремния, кроскармеллоза натрия, тальк, стеарат магния, стеарат кальция, стеарат цинка, стеариновая кислота и другие вспомогательные вещества, красители, разбавители, буферные агенты, дезинтегрирующие агенты, увлажняющие агенты, консерванты, ароматизаторы и фармакологически совместимые носители. Леденцы могут содержать активный ингредиент в ароматизаторе, обычно сахарозе и акации или трагаканте, а также пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и акация, эмульсии, гели и тому подобное, содержащие, помимо экстракта, такие носители, которые известны в данной области.

Экстракты или композиции по настоящему изобретению, например, фармацевтическая композиция, отдельно или в сочетании с другими подходящими компонентами могут быть превращены в аэрозольные препараты для введения путем ингаляции. Эти аэрозольные составы можно помещать в подходящие пропелленты под давлением, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Они также могут быть разработаны как фармацевтические препараты для приготовления препаратов без давления, например, в небулайзере или распылителе.

Составы, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают состав изотоничным по отношению к крови предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые включают суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Соединение можно вводить в физиологически приемлемом разбавителе в фармацевтическом носителе, таком как стерильная жидкость или смесь жидкостей, включая воду, физиологический раствор, водную декстрозу и родственные растворы сахара, спирт, такой как этанол, изопропанол или гексадециловый спирт, гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, кетали глицерина, такие как 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол, простые эфиры, такие как поли(этиленгликоль) 400, масло, жирная кислота, эфир жирной кислоты или глицерид, или ацетилированный глицерид жирной кислоты с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, такого как мыло или детергент, суспендирующего агента, такого как пектин, карбомеры, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза, или эмульгирующие агенты и другие фармацевтические адъюванты.

Масла, которые можно использовать в парентеральных составах, включают нефтяные, животные, растительные или синтетические масла. Конкретными примерами масел являются арахисовое, соевое, кунжутное, хлопковое, кукурузное, оливковое, вазелиновое и минеральное. Подходящие жирные кислоты для использования в парентеральных составах включают олеиновую кислоту, стеариновую кислоту и изостеариновую кислоту. Примерами подходящих эфиров жирных кислот являются этилолеат и изопропилмиристат. Подходящие мыла для использования в парентеральных составах включают жирные соли щелочных металлов, аммония и триэтаноламина, а подходящие детергенты включают (a) катионные детергенты, такие как, например, галогениды диметилдиалкиламмония и галогениды алкилпиридиния, (b) анионные детергенты, такие как, например, алкил-, арил- и олефинсульфонаты, алкил-, олефин-, эфир- и моноглицеридсульфаты и сульфосукцинаты, (c) неионные детергенты, такие как, например, оксиды жирных аминов, алканоламиды жирных кислот и сополимеры полиоксиэтилена и полипропилена, (d) амфотерные детергенты, такие как, например, алкил-β-аминоприопионаты и четвертичные аммониевые соли 2-алкилимидазолина, и (3) их смеси.

Парентеральные составы обычно содержат от около 0,5 до около 25% по весу экстракта в растворе. В таких составах можно использовать подходящие консерванты и буферы. Для минимизации или устранения раздражения в месте инъекции такие композиции могут содержать одно или несколько неионогенных поверхностно-активных веществ, имеющих гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) от примерно 12 до примерно 17. Количество поверхностно-активного вещества в таких составах составляет от примерно 5 до примерно 15% по весу. Подходящие поверхностно-активные вещества включают эфиры жирных кислот полиэтиленсорбитана, такие как моноолеат сорбитана и высокомолекулярные аддукты этиленоксида с гидрофобной основой, образованные путем конденсации пропиленоксида с пропиленгликолем. Парентеральные составы могут быть представлены в герметичных контейнерах для однократного или многократного применения, таких как ампулы и флаконы, и могут храниться в замороженном (лиофилизированном) состоянии, требуя только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Растворы и суспензии для инъекций для немедленного применения можно приготовить из стерильных порошков, гранул и таблеток описанного ранее типа.

Экстракты и композиции по настоящему изобретению могут быть включены в составы для инъекций. Требования к эффективным фармацевтическим носителям для инъекционных композиций хорошо известны специалистам в данной области. Видеть Фармацевтика и аптечная практика, J.B. Lippincott Co., Филадельфия, Пенсильвания, Banker and Chalmers, ред., страницы 238-250 (1982), и Справочник ASHP по инъекционным препаратам, Туассель, ^4-й ред., стр. 622-630 (1986).

Кроме того, экстракты по настоящему изобретению могут быть превращены в суппозитории путем смешивания с различными основами, такими как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Препараты, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев, содержащих, помимо активного ингредиента, такие носители, которые известны в данной области как подходящие.

Как указано выше, экстракты и композиции по изобретению могут быть изготовлены, представлены и/или сохранены в любой форме, а именно в форме жидкости, концентрата, сухого порошка, раствора, эмульсии или исходного раствора или исходного концентрата.

В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция предназначена для лечения или профилактики по меньшей мере одного заболевания или расстройства, связанного с повреждением, вызванным окислительным стрессом.

Окислительный стресс является результатом дисбаланса прооксидантного/антиоксидантного гомеостаза, который приводит к образованию токсичных активных форм кислорода. Свободные радикалы образуются, когда кислород взаимодействует с определенными молекулами и запускает цепную реакцию повреждения среди важных клеточных компонентов. Таким образом, воспаление и окислительные процессы взаимосвязаны. Кроме того, окислительный стресс может вызывать цитотоксичность клеток крови, стимулировать выброс воспалительных цитокинов и вызывать выработку факторов роста. Окислительный стресс играет решающую роль в образовании бляшек и наряду с присущим сосудистым воспалением может быть сильным предиктором атеросклероза.

Таким образом, в настоящем документе «повреждение, вызванное окислительным стрессом» относится к повреждению клеток, тканей и/или органов животного, включая человека, которое вызвано дисбалансом между выработкой реактивного кислорода и способностью биологической системы легко детоксифицировать реактивные промежуточные продукты или легко восстанавливать полученные повреждения. Чаще всего нарушения этого нормального окислительно-восстановительного состояния могут вызывать токсические эффекты за счет образования перекисей и свободных радикалов, которые повреждают все или определенные компоненты клетки, включая белки, липиды и ДНК.

В некоторых вариантах реализации повреждение, вызванное окислительным стрессом, связано с расстройством или заболеванием, выбранным из атеросклероза, болезни Паркинсона, сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, нейродегенеративных заболеваний или расстройств, заболеваний глаз, синдрома хронической усталости и других.

Атеросклероз, основная причина заболеваемости и смертности среди людей, ведущих западный образ жизни, развивается в результате воздействия различных факторов риска. Гиперхолестеринемия является основным фактором риска развития атеросклероза, а снижение концентрации холестерина в плазме с помощью медикаментозной терапии снижает частоту сердечно-сосудистых заболеваний. Атеросклеротическое поражение характеризуется ускоренным окислительным стрессом и образованием активных форм кислорода (АФК), которые атакуют липиды в липопротеинах, а также в артериальных макрофагах. Окислительная модификация липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) играет ключевую роль в патогенезе атеросклероза. Окисленный ЛПНП (Ох-ЛПНП) играет важную роль в развитии атеросклеротических поражений, поскольку стимулирует накопление холестерина в макрофагах и образование пенистых клеток. В отличие от атерогенности ЛПНП, уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в сыворотке крови обратно пропорционален риску атеросклероза. ЛПВП оказывает ингибирующее действие на окисление ЛПНП, и этот эффект может быть связан с его связанным ферментом параоксоназой 1 (PON1).

Атеросклероз — это также процесс или заболевание, при котором на внутренней поверхности артерий, в том числе в сердце, мозге, руках, ногах и тазу, образуются бляшки. Таким образом, этот термин может также относиться к прогрессирующему накоплению гладкомышечных клеток, иммунных клеток (например, лимфоцитов, макрофагов или моноцитов), липидных продуктов (например, липопротеинов или холестерина), продуктов жизнедеятельности клеток, кальция или других веществ во внутренней оболочке артерии, что приводит к сужению или закупорке кровеносного сосуда и развитию заболеваний, связанных с атеросклерозом.

Поскольку атеросклероз проявляется в крупных и средних артериях, лечение или профилактика часто влияют на развитие состояния хронического воспаления в артериях.

Таким образом, экстракт по настоящему изобретению также пригоден для лечения и профилактики таких состояний, как атеросклероз коронарных артерий, вызывающий ишемическую болезнь сердца, инфаркт миокарда, коронарный тромбоз и стенокардию; атеросклероз артерий, питающих центральную нервную систему, вызывающий инсульты и транзиторную ишемию мозга; атеросклероз периферических сосудов, вызывающий перемежающуюся хромоту и гангрену; атеросклероз артерии висцерального кровообращения, вызывающий мезентериальную ишемию; и стеноз почечной артерии.

Таким образом, композиция по изобретению также пригодна для использования при лечении или профилактике по меньшей мере одного заболевания или расстройства, связанного с одним или несколькими из следующих: повышенная концентрация триглицеридов липидов в сыворотке крови, концентрация холестерина в сыворотке крови, концентрация общего холестерина и холестерина ЛПНП в сыворотке крови и пониженная концентрация холестерина ЛПВП.

В настоящем документе такое заболевание или расстройство, связанное с повышением концентрации триглицеридов липидов в сыворотке крови, концентрации холестерина в сыворотке крови, концентрации общего холестерина и холестерина ЛПНП в сыворотке крови и снижением концентрации холестерина ЛПВП, включает аномально высокие уровни холестерина (гиперхолестеринемию) и/или высокие уровни ЛПНП или триглицеридов и/или более низкие концентрации функциональных ЛПВП, такие как ишемическая болезнь сердца или другие формы сердечно-сосудистых заболеваний, а также заболевания или расстройства, которые включают развитие атеромы в артериях (т. е. атеросклероз), такие как гипохолестеринемия, заболевание периферических сосудов, диабет и высокое кровяное давление.

Окислительный стресс также связан с гибелью нейронных клеток, что связано с различными нейродегенеративными заболеваниями. Нейродегенеративные заболевания — это состояния, при которых происходит потеря клеток головного и спинного мозга. Обычно нейродегенерация начинается задолго до того, как у пациента проявляются какие-либо симптомы. Поскольку клетки мозга постоянно подвергаются воздействию активных форм кислорода, образующихся в результате окислительного метаболизма, окислительный стресс также является одним из предрасполагающих факторов неврологических расстройств у взрослых и участвует в патогенезе некоторых из этих расстройств, таких как болезнь Паркинсона.

Экстракт или композиция по изобретению также используются для лечения или профилактики по крайней мере одного нейродегенеративного заболевания или расстройства.

«Нейродегенеративные заболевания или расстройства» в контексте настоящего изобретения относятся к одному или нескольким состояниям, при которых клетки головного и спинного мозга утрачиваются в результате разрушения нейронов или их миелиновой оболочки, что со временем приводит к дисфункции и инвалидности, возникающим в результате этого. Таким образом, нейродегенеративные заболевания или расстройства — это заболевания, связанные с состояниями, вызывающими проблемы с движениями, такими как атаксия, а также состояния, влияющие на память и связанные с деменцией. Некоторые неограниченные примеры нейродегенеративных заболеваний или расстройств включают алкоголизм, болезнь Александра, болезнь Альпера, болезнь Альцгеймера, боковой склероз Амиотрофии (болезнь Лу Герига), Телангектазия Атаксии, болезнь Баттена (также известная как энмистическая болезнь), заболевание), заболел-экинсиопация), заболел-экинсиопация, экинсиопация, ракообразная болезнь), B-болезнь Баль Палич, Синдром Кокейна, дегенерация кортикобаза, болезнь Крецфельдта-Якоба, дегенерация лобно-витрины, болезнь Хантингтона, деменция, связанная с ВИЧ, болезнь Кеннеди, болезнь, многоцелевая, многоцелевая, многоцелевая, элевация, эфирная болезнь, эфирная, элеоза, элеоза, элевация Олепсия, ниеманнская болезнь, болезнь Паркинсона, болезнь Пелизеуса-Мерцбахера, болезнь Пика, первичный боковой склероз, прионные заболевания, прогрессирующий надлеарный паралич, болезнь Рефсума, болезнь Сэндхоффа, болезнь Чилдера, подострая комбинированная дегенерация спинного мозга, вторичная по отношению к пернициозной анемии, спиноцеребеллярной атаксии, спинальной мышечной атрофии, болезни Стила-Ричардсона-Ольшевского и спинной сухотке.

В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или профилактики по меньшей мере одного заболевания или расстройства, связанного с повреждением, вызванным окислительным стрессом, у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества экстракта согласно изобретению или фармацевтической композиции, содержащей его.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения или профилактики по меньшей мере одного заболевания или расстройства, связанного с одним или несколькими из повышенных концентраций триглицеридов липидов в сыворотке, концентраций холестерина в сыворотке и концентраций общего холестерина и холестерина ЛПНП в сыворотке и сниженных концентраций холестерина ЛПВП у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества экстракта согласно изобретению или фармацевтической композиции, содержащей его.

В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или профилактики по меньшей мере одного нейродегенеративного заболевания или расстройства у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества экстракта согласно изобретению или фармацевтической композиции, его содержащей.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антиоксидант, содержащий экстракт изобретения.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает средство, снижающее уровень холестерина, содержащее экстракт изобретения.

В рамках настоящего изобретения термин «лечение и/или профилактика» относится к введению терапевтического количества композиции настоящего изобретения, которое эффективно для облегчения нежелательных симптомов, связанных с заболеванием, для предотвращения проявления таких симптомов до их возникновения, для замедления прогрессирования заболевания, для замедления ухудшения симптомов, для ускорения наступления периода ремиссии, для замедления необратимого ущерба, вызванного на прогрессирующей хронической стадии заболевания, для задержки наступления указанной прогрессирующей стадии, для уменьшения тяжести или излечения заболевания, для улучшения показателей выживаемости или более быстрого выздоровления или для предотвращения возникновения формы заболевания или комбинации двух или более из вышеперечисленного.

Экстракт или композицию по настоящему изобретению можно вводить любым способом, известным специалисту в данной области. Как правило, введение экстракта или фармацевтической композиции, включающей его, осуществляется в эффективном количестве экстракта(ов), входящего в состав. «Эффективное количество» для целей настоящего документа определяется с учетом соображений, известных в данной области. Количество должно быть эффективным для достижения желаемого терапевтического эффекта, как описано выше, в зависимости, в частности, от типа и тяжести заболевания, подлежащего лечению, а также схемы лечения. Эффективное количество обычно определяется в ходе надлежащим образом спланированных клинических испытаний (например, исследований диапазона доз), и специалист в данной области будет знать, как правильно проводить такие испытания, чтобы определить эффективное количество. Как известно, эффективное количество зависит от множества факторов, включая сродство лиганда к рецептору, профиль его распределения в организме, множество фармакологических параметров, таких как период полувыведения из организма, нежелательные побочные эффекты, если таковые имеются, такие факторы, как возраст и пол и т. д.

Экстракт по настоящему изобретению может также использоваться для приготовления композиции для использования в различных нефармацевтических целях. В некоторых вариантах реализации композиция представляет собой антиоксидантную композицию для использования в качестве консерванта для широкого спектра применений в пищевой промышленности, косметической промышленности, терапии и т. д., а также для ингибирования окисления ЛПНП, вызванного ионами меди in vitro или in vivo.

Описанный здесь экстракт может быть дополнительно использован в качестве пищевой добавки или в качестве активного компонента такой добавки. В некоторых вариантах реализации добавка подходит для употребления как людьми, так и животными, для поддержания хорошего самочувствия, а также лечения и профилактики состояний и расстройств, связанных с окислительным повреждением.

В контексте настоящего изобретения пищевая добавка, в зависимости от ее природы и физической формы, например, липофильная или гидрофильная по своей природе, может дополнительно содержать один или несколько эмульгаторов, стабилизаторов, антиоксидантов и других добавок. Используются эмульгаторы, совместимые с пищевыми продуктами, такие как фосфолипиды, например, лецитин, полиоксиэтиленсорбитан моно- или тристеарат, монолаурат, монопальмитат, моно- или триолеат, моно- или диглицерид. Эти эмульгаторы, стабилизаторы, антиоксиданты и добавки могут быть добавлены к экстракту по изобретению в зависимости от конечного использования указанного экстракта.

Раскрытая здесь пищевая добавка может также содержать синтетические или натуральные биоактивные вещества, такие как аминокислоты, жирные кислоты, витамины, минералы, полифенолы и т. д., которые могут быть добавлены либо путем сухого, либо путем влажного смешивания к указанной композиции перед пастеризацией и/или сушкой.

В некоторых вариантах реализации пищевая добавка представляет собой полноценную питательную смесь, молочный продукт, охлажденный или долго хранящийся напиток, минеральную или очищенную воду, жидкий напиток, суп, диетическую добавку, заменитель пищи, питательный батончик, кондитерские изделия, молоко или кисломолочный продукт, йогурт, порошок на основе молока, продукт энтерального питания, детскую смесь, продукт детского питания, зерновой продукт или продукт на основе ферментированных злаков, мороженое, шоколад, кофе, кулинарный продукт, такой как майонез, томатное пюре или заправки для салатов, или корм для домашних животных. Согласно этим вариантам реализации экстракт по изобретению может быть диспергирован в пищевых продуктах или напитках таким образом, чтобы обеспечить ежедневное потребление биологически активных питательных веществ, что зависит главным образом от типа пищи, в которой диспергирован экстракт, желаемого эффекта и целевой ткани. Количество пищевой добавки, которое необходимо потреблять человеку для получения полезного эффекта, также будет зависеть от одного или нескольких различных факторов, таких как тип добавки и/или пищи, а также возраст и вес потребителя.

Пищевая добавка для перорального применения может быть в капсулах, желатиновых капсулах, мягких капсулах, таблетках, драже, пилюлях, пастилках или пастилках, жевательных резинках или питьевых растворах или эмульсиях, сиропе или геле с дозой примерно от 0,1 до 100% экстракта по изобретению, который затем можно принимать непосредственно с водой или любым другим известным способом. Эта добавка может также включать подсластитель, стабилизатор, антиоксидант, добавку, ароматизатор или краситель.

Понятно, что некоторые признаки изобретения, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, могут также быть представлены в комбинации в одном варианте осуществления. Наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описаны в контексте одного варианта реализации, могут также быть представлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации или как подходящие в любом другом описанном варианте реализации изобретения. Некоторые особенности, описанные в контексте различных вариантов реализации, не следует считать существенными особенностями этих вариантов реализации, если только вариант реализации не является неработоспособным без этих элементов.

В настоящем документе процесс, экстракт или композиции изобретения могут включать дополнительные этапы, ингредиенты или части, только если дополнительные этапы, ингредиенты или части не изменяют основные и новые характеристики заявленного процесса, экстракта и композиций. В настоящем документе формы единственного числа «a», «an» и «the» включают ссылки на множественное число, если контекст явно не требует иного.

Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, описанные выше и заявленные в разделе формулы изобретения ниже, находят экспериментальное подтверждение в следующих примерах.

1. Сушка сока марулы

Плоды марулы собирали с земли в течение 10 дней с момента падения с деревьев, а затем отжимали с помощью гидравлического пресса под давлением 35 бар (пресс для оливок Enorossi, модель 250). Сок собирали и хранили в замороженном виде при температуре -20°С в течение различных периодов времени до 3 лет. Непосредственно перед сушкой сок размораживали и разливали по противням из алюминиевой фольги, образуя равномерный слой толщиной 0,7 см. Поддоны с соком помещали в вакуумную печь (Tuttnauer, сушильный стерилизатор, модель 11-900), установленную на 57°C и -760 мм рт. ст., на период в 3 дня. После высушивания твердое вещество, содержащее около 1% влаги, измельчалось до получения порошка, легко растворимого в воде. Порошок хранился в эксикаторе при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

2. Препараты экстракта марулы

А. Этанольный экстракт (далее именуемый «Экстракт I»)

Для приготовления экстракта I 15 г высушенного сока марулы измельчали ​​до порошкообразного состояния, суспендировали в 50 мл 50% этанола и помещали на шейкер на 20 мин. Суспензию центрифугировали и супернатант переносили в круглую колбу. Этот этап повторяли с дополнительными 25 мл 50% этанола. Два супернатанта объединили, а этанол и часть воды удалили с помощью роторного испарителя. Конечный водный раствор объемом 30 мл имел антиоксидантную способность FRAP (окислительно-восстановительную способность железа) 1390 мг эквивалентов витамина С на 100 мл (в 3 раза больше антиоксидантной способности по сравнению с 460 мг эквивалентов витамина С на 100 мл, измеренными в исходном соке). Экстракт I можно восстановить в воде.

B. Фракция, обедненная полифенолами (далее именуемая «Экстракт II»):

Для приготовления экстракта II цельный сок марулы пропускали через 8 слоев марли и центрифугировали для удаления остатков плодовой ткани. 200 мл прозрачного сока наносили на колонку Sepabeads объемом 20 мл со скоростью потока 0,4 мл/мин. Были собраны фракции объемом 12 мл. Фракции, содержащие такую ​​же общую концентрацию растворимых сухих веществ (TSS), как и прозрачный сок (12,9%), были объединены. Антиоксидантная активность FRAP, измеренная в этой фракции, составила 379 мг эквивалента витамина С на 100 мл, что составляет примерно 83% от измеренной в прозрачном соке, нанесенном на колонку.

C. Полифенольная фракция (далее именуемая «Экстракт III»).

Для приготовления экстракта III применялась периодическая экстракция с целью высвобождения полифенолов из бусинок колонки, описанных выше. Гранулы переносили в стеклянную колбу с широким дном и тщательно перемешивали с 85% раствором этанола. Спиртовой раствор извлекали, и этап повторяли до тех пор, пока экстракционный раствор не становился бесцветным. Собранные этанольные растворы объединяли, помещали в круглую колбу и упаривали досуха на роторном испарителе. Сухую пленку растворяли в 1 мл воды. Полученный продукт имел активность FRAP 5735 мг эквивалента витамина С на 100 мл, что примерно в 12 раз превышает активность, измеренную в исходном соке.

Для получения обогащенного полифенолами напитка из марулы 15 мл обедненной полифенолами фракции сока (экстракт II) смешивали с выделенной полифенольной фракцией (экстракт III); Вода была добавлена ​​к конечному объему 25 мл напитка марулы (содержащего описанные здесь экстракты II и III) с антиоксидантной активностью FRAP 446 мг эквивалентов витамина С на 100 мл, из которых 50% приходилось на витамин С и 50% на полифенолы, по сравнению с ~75% и 25% соответственно в исходном соке.

Общие полифенолы определяли спектрофотометрически методом Синглтона, модифицированным для малых объемов [Singleton VL, et al, Am. Ж. Этология и виноградарство 16:144-158, 1965]. В качестве стандарта использовалась галловая кислота (ГК). Исходный раствор ГА готовили в воде в концентрации 2 мМ. Для стандартной кривой использовались объемы 10, 20, 40 и 60 микролитров. Затем результаты были выражены в виде эквивалентов ГА (GAE). Иногда пирогаллол заменял ГА в качестве стандарта.

3. Методы in vitro

ИНЖИР. 1  показана общая концентрация полифенолов в каждом из отфильтрованного сока марулы, этанольного экстракта высушенного сока марулы (экстракт I) и продукта, полученного путем объединения описанных здесь экстрактов II и III. Общая концентрация составила 7,15, 8,34 и 9,35 мг эквивалентов галловой кислоты (ГАК)/мл соответственно.

ИНЖИР. 2  представлены хроматограммы ВЭЖХ сока марулы и экстрактов сока. Каждый экстракт сока промывали (1:3) 80% метанолом с добавлением 2 мМ NaF для извлечения антиоксидантов. Суспензию центрифугировали, а супернатант фильтровали через фильтр 0,45 мкм перед инъекцией. Образцы объемом 20 мкл анализировались с использованием системы ВЭЖХ LaChrom Merck Hitachi, состоящей из насоса L7100, колоночной печи L7350 (установленной на 28 °C), смесителя-дегазатора L-7614 и ручного инжектора Rheodyne, соединенных с многоволновым детектором (Jasco MD-2010 Plus), интерфейсом (Jasco LC-Net II/ADC) и научным программным обеспечением (EZChrom Elite Client/Server версии 3.1.6, сборки 3.1.6.2433). Использовалась колонка Purospher®Star RP-18 с концевым колпачком (картридж LichroCART® 250×4 мм, размер частиц 5 мкм) с концевым колпачком Lichrospher®100 RP-18 (картридж LichroCART® 4×4 мм, размер частиц 5 мкм).

Конец колонки был соединен с коллектором фракций (Pharmacia Fine Chemicals, FRAC-100). Подвижные фазы состояли из (A) фосфорной кислоты (0,1%), pH 2,4, и (B) метанола; Градиент элюирования был установлен таким образом, чтобы от 0 до 100% метанола за 30 минут. Скорость потока составила 0,6 мл мин ⁻¹ .

Концентрацию витамина С оценивали по площади под соответствующими пиками хроматограммы, используя для калибровки витамин С класса ВЭЖХ (Fluka). Метанол был марки «HPLC» (LiChrosolv Merck); вода очищалась и фильтровалась с использованием известных процедур; Фосфорная кислота (Frutarom) и NaF (Sigma) были аналитической чистоты. Стандартная библиотека фенолов была создана с использованием катехина, хлорогеновой, кофейной и дубильной кислот от Sigma, а также 2-гидроксибензойной (салициловой) кислоты, кверцетин-3-β-глюкозида и эллаговой кислоты от Fluka.

Как показывают хроматограммы ВЭЖХ, каждый экстракт I, II, III имел уникальный состав в отношении фенольных соединений [фенольные кислоты (ФК) и танины (Т)] и витамина С. Три экстракта значительно отличались по своему антиоксидантному составу по сравнению с исходным соком.

Способность продуктов из сока марулы поглощать свободные радикалы также анализировалась с помощью анализа DPPH [Malterud KM, Farbort TL, Huse ACE, Bredo Sund R. Антиоксидантные и поглощающие радикалы эффекты артрахинонов и анторонов. Фармакология. 1993: 47: 77-85]. DPPH (1,1-дифенил-2-пикрилгидразил) — вещество, генерирующее свободные радикалы, которое широко используется для мониторинга способности различных антиоксидантов поглощать свободные радикалы (способности соединения отдавать электрон). Радикал DPPH имеет глубокий фиолетовый цвет из-за ослабленного электрона, а поглощение радикала можно отслеживать спектрофотометрически по потере поглощения при 517 нм, поскольку образуется бледно-желтая нерадикальная форма.

Аликвоты продукта сока марулы (1,0 мкл) смешивали с 1 мл 0,1 ммоль DPPH/л в этаноле и непрерывно контролировали изменение оптической плотности при 517 нм. Способность экстрактов сока марулы очищать свободные радикалы сравнивалась со способностью фильтрованного сока марулы очищать свободные радикалы ( ИНЖИР. 3А и 3Б ).

При концентрации 1,0 мкл/мл отфильтрованный сок марулы вызывал 30%-ное снижение оптической плотности при 517 нм, тогда как продукт, полученный путем объединения описанных здесь экстрактов II и III (например, сок марулы, обогащенный высоким содержанием полифенолов), вызывал 21%-ное снижение оптической плотности при 517 нм. Наиболее выраженную способность к поглощению радикалов проявил экстракт I, который вызвал 54%-ное снижение оптической плотности при 517 нм ( ИНЖИР. 3А ). При более высоких концентрациях (2,0 мкл/мл) отфильтрованный и центрифугированный сок марулы вызывал 60%-ное снижение оптической плотности при 517 нм. Аналогичным образом, продукт, полученный путем объединения описанных здесь экстрактов II и III, вызвал 43%-ное снижение оптической плотности при 517 нм, а наиболее заметную способность к поглощению радикалов снова продемонстрировал экстракт I, который вызвал 89%-ное снижение оптической плотности при 517 нм ( ИНЖИР. 3Б ).

ЛПНП выделяли из плазмы, полученной от здоровых добровольцев с нормолипидемией, методом ультрацентрифугирования в прерывистом градиенте плотности [Авирам, М. (1983) Разделение липопротеинов плазмы методом ультрацентрифугирования в прерывистом градиенте плотности у пациентов с гиперлипопротеинемией. Биохим. Мед. 30, 111-118]. ЛПНП промывали при d=1,063 г/мл, диализовали против 150 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л _Na2EDTA (pH 7,4) при 4°C. Затем ЛПНП стерилизовали фильтрацией (0,45 мкМ), хранили в атмосфере азота в темноте при 4°C и использовали в течение 2 недель. Концентрацию белка ЛПНП определяли с помощью реагента Фолина-фенола. Перед окислением ЛПНП подвергали диализу против фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), не содержащего ЭДТА, с pH 7,4 и температурой 4°C.

ЛПНП (100 мкг белка/мл) инкубировали в течение десяти минут при комнатной температуре с возрастающими концентрациями экстрактов сока марулы. Затем 5 мкмоль/л CuSO ₄ был добавлен, и пробирки инкубировались в течение 2 часов при температуре 37 °C. В конце инкубации степень окисления ЛПНП определялась путем измерения образовавшегося количества веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (TBARS), и перекисей липидов [Aviram M, Vaya J. Маркеры окисления липопротеинов низкой плотности. Методы энзимол. 2001; 335:244-56; и Буэге JA, Ауст SD Микросомальное перекисное окисление липидов. Методы энзимол. 52: 302-310 (1978)]. Тест на перекись липидов (PD) анализирует образование перекиси липидов по их способности преобразовывать йодид в йод после инкубации в течение 18 часов при 25 °C, измеренной спектрофотометрически при 365 нм [G. Юргенс. Спектрофотометрический анализ липидных перекисей в липопротеинах сыворотки с использованием коммерчески доступного реагента. Журнал исследований липидов. 30: 627-630, 1986].

Окисление ЛПНП измерялось как TBARS ( ИНЖИР. 4А ) или как образование липидных перекисей ( ИНЖИР. 4Б ). Добавление возрастающих концентраций экстрактов сока марулы ингибировало окисление ЛПНП, вызванное ионами меди, в зависимости от дозы. ИК ₅₀ (ингибирование окисления ЛПНП на 50%) значение для отфильтрованного и центрифугированного сока марулы составило 0,80 мкл/мл для TBARS ( ИНЖИР. 5А ) и 0,65 мкл/мл для липидных перекисей ( ИНЖИР. 5Б ) формирование. Несколько более низкие результаты были получены для экстракта I (0,50 мкл/мл как для образования ТБК-ресивер, так и для образования липидных перекисей). Напротив, IC ₅₀ Значение для продукта, полученного путем объединения описанных здесь экстрактов II и III, было самым высоким (1,35 и 1,50 для ТБК и для липидных перекисей соответственно).

Макрофаги J-774A.1 были предварительно инкубированы с 10 и 30 мкг эквивалентов GAE/мл продуктов сока марулы, а затем клетки были проанализированы на предмет их атерогенности, которая оценивалась как окислительный статус макрофагов, поглощение макрофагами липопротеинов, отток холестерина, опосредованный ЛПВП, и биосинтез холестерина.

Окислительный статус макрофагов определяли методом проточной цитометрии с дихлорфлуоресцин-диацетатом (DCFH-DA). DCFH-DA — неполярный краситель, который диффундирует в клетки. В клетках он гидролизуется в нефлуоресцентное производное 2′,7′-дихлорфлуоресцин (DCFH), которое является полярным и удерживается внутри клеток. Под воздействием окислительного стресса DCFH окисляется до DCF, который является флуоресцентным соединением. Макрофаги J774 A.1 (2×10 ⁶ ) инкубировали с 2,5×10 ⁻⁵ моль/л DCFH-DA в течение 30 минут при 37° C. Реакцию останавливали промывкой PBS при 4° C. Клеточную флуоресценцию определяли с помощью аппарата для проточной цитометрии (FACS-SCAN, Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США). Измерения проводились в диапазоне длин волн от 510 до 540 нм после возбуждения клеток аргоновым ионным лазером при длине волны 488 нм.

Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при температуре 37 °C с экстрактом I и отфильтрованным соком марулы снизила клеточный окислительный стресс, измеренный с помощью анализа DCFH, на 6% и 7% соответственно. Продукт, полученный путем объединения описанных здесь экстрактов II и III, не оказал влияния на статус окислительного стресса макрофагов ( ИНЖИР. 6 ).

ЛПНП (1 мг/мл) инкубировали в течение 18 часов при температуре 37°С с 5 мкмоль/л свежеприготовленного _CuSO4 . Окисление прекращали путем охлаждения до 4°С. Степень окисления ЛПНП определяли с помощью анализа TBARS.

ЛПНП и окс-ЛПНП были конъюгированы с фторизотиоцианатом (ФИТЦ) для исследований клеточного поглощения. Липопротеины (2,5 мг белка/мл) диализовали в течение ночи при температуре 4°С против нескольких смен боратного буфера, содержащего 0,1 М бората, 25 мМ тетрабората натрия, 75 мМ NaCl, pH 8,6. Перед конъюгацией (1 ч) pH диализного буфера был изменен до 9,4. Флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ; Sigma-Aldrich) растворяли в диметилформамиде (Merck) и по каплям добавляли к раствору липопротеинов до конечной концентрации 0,2 мг/мл, а затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. Липопротеины, конъюгированные с ФИТЦ, отделяли от неконъюгированного ФИТЦ методом эксклюзионной хроматографии на колонке PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech) с элюированием 10 мМ фосфатным буфером, pH 8,0. Липопротеины, меченые ФИТЦ (2 мг/мл), использовались сразу же в исследованиях поглощения.

Макрофаги J774 A.1 инкубировали при температуре 37° C в течение 3 часов с ЛПНП, конъюгированными с ФИТЦ, или Ox-ЛПНП в конечной концентрации 25 мкг белка/мл. Поглощение липопротеина определялось методом проточной цитометрии. Измерения клеточной флуоресценции, определяемые методом FACS, проводились в диапазоне длин волн от 510 нм до 540 нм после возбуждения клеток аргоновым ионным лазером на длине волны 488 нм. Клеточную флуоресценцию измеряли по средней интенсивности флуоресценции (MFI).

Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при температуре 37 °C с продуктами из сока марулы (10 мкг/мл ГАЭ) не оказала влияния на поглощение ЛПНП макрофагами. При более высокой концентрации ГАЭ 30 мкг/мл только продукт, содержащий описанные здесь экстракты II и III, снизил поглощение ЛПНП макрофагами на 9% ( ИНЖИР. 7 ). Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при температуре 37 °C с экстрактом I, продуктом, полученным путем объединения описанных здесь экстрактов II и III и отфильтрованного сока марулы, либо при 10 мкг/мл GAE, либо при 30 мкг/мл GAE, снизила поглощение макрофагами Ox-LDL на 12% и 7% (экстракт I), на 27% (сок марулы с высоким содержанием полифенолов) и на 8% и 6% (отфильтрованный сок марулы) соответственно ( ИНЖИР. 8 ).

Макрофаги J774 A.1 инкубировали с холестерином, меченым [ ³ H] (2 мкКи/мл), в течение 1 часа при 37 °C, после чего клетки промывали в ледяном PBS (×3) и далее инкубировали в отсутствие или в присутствии 100 мкг белка ЛПВП/мл в течение 3 часов при 37 °C. Клеточные и средние [ ³ H]-метки количественно определяли, а отток холестерина, опосредованный ЛПВП, рассчитывали как отношение [ ³ H]-метки в среде/([ ³ H]-метка в среде+[ ³ H]-метка в клетках). Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при температуре 37 °C с отфильтрованным соком марулы (10 мкг/мл GAE) увеличила отток холестерина из макрофагов в ЛПВП примерно на 10%. Однако все остальные продукты из сока марулы не влияли на отток холестерина, опосредованный ЛПВП, ни при какой концентрации ( ИНЖИР. 9 ).

Макрофаги J774 A.1 инкубировали с [ ^3H ] ацетатом, после чего проводили экстракцию клеточных липидов с помощью гексана:изопропанола (3:2, об./об.) и разделение методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем. Пятна неэтерифицированного холестерина визуализировались парами йода, соскабливались в сцинтилляционные пробирки и подсчитывались на радиоактивность. Инкубация макрофагов J-774 A.1 в течение 18 часов при температуре 37 °C с экстрактом I, продуктом, полученным путем объединения описанных здесь экстрактов II и III, и сока марулы после фильтрации, все в концентрации 30 мкг/мл GAE, снизила биосинтез холестерина в макрофагах на 18%, 7% и 8% соответственно ( ИНЖИР. 10 ).

Новорожденные крысы породы Вистар были получены из Harlan Laboratories. Культуры первичных крысиных астроцитов были приготовлены из коры головного мозга 1-2-дневных новорожденных крыс породы Вистар. Данная процедура была одобрена Комитетом по уходу и использованию животных. Астроциты высевали в 24-луночные планшеты по 100 000 или 80 000 клеток/0,5 мл/лунку соответственно. Все эксперименты проводились в присутствии 2% сыворотки (FCS). Исходную среду клеток отсасывали и добавляли к клеткам свежую среду. Разбавления H ₂ O ₂ и соки марулы в питательной среде готовились из свежих исходных растворов непосредственно перед каждым экспериментом и использовались немедленно. Каждое лечение проводилось в четырех повторностях. Конечная концентрация H ₂ O ₂ составила 200 мкМ.

Анализы культуры нейрональных клеток

Определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток определялась с помощью коммерческого набора для колориметрического анализа (поставляемого компанией Roche) на основе измерения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), высвобождаемой из цитозоля поврежденных клеток в супернатант.

Защитные эффекты экстрактов — Чтобы определить оптимальные условия (по времени и дозе) для того, чтобы соки проявили свой предполагаемый защитный эффект, клетки предварительно обрабатывали различными количествами каждого сокового продукта в течение различных периодов времени, и защитные эффекты продуктов против окислительного стресса, вызванного H ₂ O ₂ были оценены. Соки (в разведении 1:125, 1:500, 1:800 и 1:4000) добавлялись одновременно с H ₂ O ₂ или предварительно инкубировали в течение двух часов с клетками перед его добавлением. Токсичность контролировали через 20 часов. ИНЖИР. 11  показывает, что при всех протестированных концентрациях и для всех соковых продуктов одновременное добавление соков с H ₂ O ₂ не является защитным. Однако предварительная инкубация в течение 2 часов с клетками перед H ₂ O ₂ Добавление привело к защитному эффекту всех соков, при этом экстракт I продемонстрировал наиболее эффективную защитную активность при использовании в низких концентрациях (1:4000).

Эксперименты с экстрактами марулы в низких концентрациях (разведения 1:1000–1:8000). Следующие эксперименты проводились при более низких концентрациях продуктов (разведения 1:1000–1:8000), что составляет ~55–450 мкг/100 мл эквивалента витамина С.

Были исследованы эффекты периода предварительной инкубации (2 часа против 6 часов) клеток с соковой продукцией и концентрации продукта (1:1000–1:8000). ИНЖИР. 12  показывает, что в то время как 2 часа преинкубации с экстрактом I вызывали только ~20% защиты при всех протестированных концентрациях, 6 часов преинкубации привели к более чем 80% защите.

В другом эксперименте влияние времени инкубации и концентрации проверялось с 2 разведениями (1:1000 или 1:4000) каждого сока, отфильтрованного сока марулы и экстракта I в течение 2 или 6 часов перед добавлением H ₂ O _{2 .} ( ИНЖИР. 13 ). Экстракт I оказался наиболее эффективным (70% защиты). Отфильтрованный сок марулы также продемонстрировал значительную защитную активность (40% защиты).

4. Клинический протокол

Для исследования были отобраны десять здоровых добровольцев (таблица 1), некурящих, не имеющих нарушений обмена веществ, с уровнем холестерина в плазме ниже 200 мг/дл и не получающих медикаментозного лечения. Перед началом исследования все испытуемые подписали форму согласия. Протокол исследования был одобрен Хельсинкским комитетом Рамбама (№ 2452).

Все участники употребляли 200 мл пастеризованного сока в день во время основного приема пищи в течение 3 недель. Все субъекты, включенные в исследование, продолжали вести обычный образ жизни. Артериальное давление измерялось в нулевой момент времени (до начала исследования), через 3 недели и в конце исследования (после 4 недель вымывания). Образцы крови (25 мл) собирались для анализа в нулевой момент времени (исходный момент — до начала исследования), через 3 недели употребления сока марулы и через 4 недели после окончания употребления сока (вымывание).

Все образцы сыворотки крови были заморожены при температуре -80°С до проведения анализа. Биохимические анализы сыворотки проводились с использованием имеющихся в продаже диагностических наборов и включали измерение уровня глюкозы, кальция, функции почек (АМК, креатинин и электролиты натрий и калий), функции печени (КК, АСТ и общий билирубин), общего холестерина, холестерина ЛПВП, холестерина ЛПНП и общих триглицеридов. Уровень мочевой кислоты (как возможного антиоксиданта) в сыворотке измерялся с помощью имеющегося в продаже набора.

Анализ образцов сыворотки на окислительный стресс

Железовосстанавливающий антиоксидантный реагент (FRAP): Рабочий реагент FRAP был приготовлен путем смешивания 25 мл ацетатного буфера, 2,5 мл раствора 2,4,6-трипиридил-s-триазина (TPTZ) и 2,5 мл раствора FeCL ₃ *6H ₂ O. Для стандартной калибровочной кривой использовали водные растворы 1 мМ _FeSO4 * _7H2O в концентрациях 5, 10, 20, 30, 40, 50 и 100 мМ. Реагент FRAP (свежеприготовленный) нагревали до 37°C, и считывали холостой раствор реагента при 593 нм спектрофотометрически. Образец сыворотки (30 мкл) смешивали с 90 мкл воды. Затем добавили 900 мкл реагента FRAP и быстро перемешали. Поглощение считывалось через 0,5 секунды и каждые 15 секунд в течение 4 минут. Для каждого образца рассчитывалось изменение поглощения (A _{593 нм} ) между конечной и начальной оптической плотностью, а затем оно было связано с Fe ⁺² концентрация в стандартной кривой (тестируется параллельно).

Перекисное окисление липидов в сыворотке

Сыворотку разбавляли 1:4 (об.:об.) фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), а затем инкубировали в отсутствие или в присутствии 100 ммоль/л генератора свободных радикалов 2,2′-азобис-2-амидинопропана гидрохлорида (AAPH) в течение 2 часов при температуре 37 °C. Перекисное окисление липидов сыворотки определяли путем измерения образовавшегося количества веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (TBARS), и перекисей липидов с использованием спектрофотометрических методов. Тест на перекись липидов (ПД) анализирует образование перекиси липидов по их способности преобразовывать йодид в йод после инкубации в течение 18 часов при температуре 25 °C, измеренной спектрофотометрически при 365 нм.

Как показывают результаты исследования, потребление не оказало существенного влияния на артериальное давление; Уровни глюкозы и кальция в сыворотке крови существенно не изменились после употребления, а результаты тестов на функцию почек существенно не изменились при продолжительном употреблении. Аналогичным образом, потребление привело к существенному изменению уровня электролитов в крови и функции печени. Однако уровень триглицеридов в сыворотке снизился на 7% после приема, причем эффект сохранялся после 4-недельного периода вымывания (таблица 2).

Потребление в течение 3 недель значительно (p<0,02) снизило концентрацию общего холестерина в сыворотке крови на 8% (таблица 3).

Это снижение может быть связано со значительным (p<0,01) снижением уровня холестерина ЛПНП на 17%. Однако эти снижения не сохранились после периода вымывания, поскольку уровни общего холестерина, а также холестерина ЛПНП вернулись к исходным значениям после 4 недель периода вымывания, в течение которого испытуемый не употреблял сок. Уровень холестерина ЛПВП в сыворотке крови значительно увеличился (p<0,03) на 10% после употребления сока, и это снижение сохранялось, хотя и в меньшей степени (всего на 7%), после периода вымывания.

В таблице 4 показано влияние на окислительный стресс в сыворотке. Образцы сыворотки были подвергнуты окислению, вызванному AAPH. Образование перекиси липидов значительно (p<0,03) снизилось в образцах сыворотки, полученных после употребления в течение 3 недель. Однако этот эффект не сохранился после периода вымывания. В образцах сыворотки, полученных после потребления, «антиоксидантная сила», измеренная с помощью анализа FRAP, увеличивалась в период потребления и увеличивалась еще больше, достигнув значительного повышения на 8% после периода вымывания. Снижение окислительного стресса в сыворотке может быть результатом снижения концентрации липидов в сыворотке (меньше субстрата, доступного для окисления, а также эффекта мощных антиоксидантов сока марулы).

Влияние потребления пастеризованного сока на окислительный стресс в сыворотке крови обобщено в ИНЖИР. 14А-Б . Образцы сыворотки были подвергнуты окислению, вызванному AAPH. Образование перекиси липидов ( ИНЖИР. 14А ) значительно (p<0,03) снизился в образцах сыворотки, полученных после употребления сока в течение 3 недель. Этот эффект не сохранился после периода вымывания. Мощность антиоксидантной активности, измеренная с помощью анализа FRAP ( ИНЖИР. 14Б ), увеличился в образцах сыворотки, полученных после употребления пастеризованного сока марулы, и, что удивительно, увеличился еще больше, достигнув значительного повышения на 8% после периода вымывания.