مستخلصات نبات سكلوكاريا بيريا (US8445040B2)

تتعلق الاختراع الحالي عمومًا بالمستخلصات القابلة للذوبان في الماء والتي يتم الحصول عليها من سكلوكاريا بيريا الفاكهة واستخداماتها.

المارولا ( Sclerocarya birrea، العائلة: Anacardiaceae) هي شجرة نفضية متوسطة إلى كبيرة الحجم ذات جذع منتصب وتاج مستدير. ويستخدم النبات كمصدر للغذاء اليوم كما كان يستخدم في العصور القديمة. تعتبر ثمار المارولا صالحة للأكل، وعادة ما تؤكل نيئة أو يتم معالجتها في مجموعة متنوعة من المنتجات الغذائية مثل الجيلي، كما يتم تخميرها في شكل بيرة كحولية، والمعروفة لدى شعب فهافيندا باسم موكومبي.

تشمل الاستخدامات الطبية وتطبيقات المارولا استخدام اللحاء والأوراق لعلاج الأمراض المرتبطة بالبكتيريا والسكري [1،2] وكذلك الإسهال كما هو موضح في منشور براءة الاختراع الأسترالي رقم. 2000/29790 [3].

النشر الدولي رقم. يكشف تقرير WO 03/092634 [4] عن استخدام زيت المارولا في المستحضرات الموضعية لمنع تكوين النسيج الندبي على الجلد.

لقد ثبت أن فاكهة المارولا تمتلك قدرة مضادة للأكسدة الكلية المتزايدة [5]، ولديها القدرة على تثبيط بيروكسيد الفسفوليبيد ولها نشاط إزالة الجذور الحرة للأنيون الفائق [6]. النشر الدولي رقم. يكشف براءة الاختراع WO 06/097806 [7] أن أجزاء مختلفة من نبات المارولا مثل اللحاء والأوراق والفواكه والجذور والبذور تحتوي على مضادات الأكسدة الكارهة للماء، والتي يمكن الحصول عليها من النبات عن طريق النقع و/أو الاستخراج.

المنشورات

على الرغم من التقارير التي تفيد بأن فاكهة المارولا غنية بمضادات الأكسدة، إلا أن تحضير واستخدام مستخلصات فاكهة المارولا في علاج الأمراض والاضطرابات مثل تصلب الشرايين والأمراض العصبية التنكسية لم يتم الإبلاغ عنها حتى الآن.

وتشير النتائج المذهلة التي تم الكشف عنها هنا إلى أن المستخلصات المحضرة من عصير المارولا ليست مستقرة لفترات طويلة من الزمن فحسب، بل والأهم من ذلك أنها تمتلك فوائد علاجية مختلفة وفي بعض الحالات أفضل من تلك التي أظهرها عصير المارولا غير المعالج. لقد ثبت أن مستخلصات الاختراع تؤثر بشكل إيجابي على الدهون في الدم، كما يتضح من خلال انخفاض LDL في المصل، وزيادة HDL في المصل، وتخفيف الإجهاد التأكسدي في المصل؛ وقد أثبتت المستخلصات فعاليتها في علاج أضرار الإجهاد التأكسدي، وتصلب الشرايين، والتنكس العصبي والاضطرابات المرتبطة بها.

كما أن مستخلصات عصير المارولا وفقًا للاختراع الحالي فعالة أيضًا في منع التنكس العصبي، كما يتضح من تأثيرها الوقائي على الخلايا العصبية المعرضة لتلف الجذور الحرة.

يكشف الاختراع الحالي أيضًا عن استخدام مستخلصات عصير المارولا كمضادات للأكسدة للاستخدام في مجموعة كبيرة ومتنوعة من التطبيقات، على سبيل المثال، الاستخدام في المكملات الغذائية لتوليد، على سبيل المثال، تأثير مضاد لتصلب الشرايين في الأشخاص الأصحاء وغير الأصحاء (البشر والحيوانات غير البشرية) وكعوامل لعلاج أو منع الأمراض العصبية التنكسية المرتبطة.

وهكذا، في أحد جوانب الاختراع الحالي، يتم توفير مستخلص مشتق من فاكهة المارولا، باستثناء البذور، حيث يتم الحصول على المستخلص من خلال عملية تتضمن إخضاع العصير المجمع من فاكهة المارولا لعملية استخلاص باستخدام واحد أو أكثر من المحاليل المائية والمذيبات العضوية وخليط منهما، أي للحصول بذلك من عصير المارولا على مستخلص يتمتع بالفوائد البيولوجية المرغوبة.

يمكن تصفية عصير المارولا المستخرج من ثمار المارولا قبل استخراجه من أجل إزالة بقايا الفاكهة مثل بقايا البذور وغيرها من المواد غير القابلة للذوبان. يمكن إجراء الترشيح باستخدام أي طريقة معروفة في مجال ترشيح المشروبات، مثل، على سبيل المثال لا الحصر، ترشيح التراب الدياتومي (DE) والترشيح الغشائي.

في بعض التجسيدات، يتم بسترة عصير المارولا الذي يتم الحصول عليه من ثمار المارولا قبل الاستخلاص من أجل إبطاء نمو الميكروبات في العصير عن طريق تقليل عدد مسببات الأمراض القابلة للحياة فيه. وعادة ما تتم عملية البسترة عن طريق تعريض العصير لدرجات حرارة أقل من الغليان. في بعض التجسيدات، يتم تحقيق البسترة بواسطة طريقة أو أكثر من طرق البسترة الأخرى المعروفة في المجال، على سبيل المثال، التي تسيطر عليها وكالات سلامة الأغذية الوطنية (مثل وزارة الزراعة الأمريكية في الولايات المتحدة ووكالة معايير الأغذية في المملكة المتحدة). تتضمن بعض الأمثلة غير المقيدة البسترة بدرجة حرارة عالية/وقت قصير (HTST)، والبسترة بمدة صلاحية ممتدة (ESL)، والبسترة بدرجة حرارة فائقة الارتفاع (UHT أو المعالجة بالحرارة الفائقة)، والبسترة على دفعات أو في حوض.

يشير مصطلح "المستخلص" كما هو مستخدم هنا إلى منتج قابل للذوبان في الماء يتم الحصول عليه من أي جزء من ثمرة المارولا أو أي جزء مشتق منها، باستثناء البذور، ولكن بما في ذلك واحد أو أكثر من القشرة المتوسطة، والقشرة الداخلية، والقشرة (الجلد الخارجي السميك)، و/أو الجلد (القشرة الخارجية)، من خلال استخدام طريقة مختارة من التعبير، والامتصاص، والنقع، والتجفيف بالتجميد، والتقطير وأي تركيبة من اثنتين أو أكثر من هذه العمليات.

يمكن تشكيل المواد المستخرجة، بشكل منفصل أو مجتمعة، في أي تركيبة مرغوبة بما في ذلك محلول مائي، أو مادة صلبة مثل مسحوق جاف، أو حبيبات أو كريات، أو مركز، مثل شبه سائل له قوام شرابي يمكن الحصول عليه عن طريق تبخير كل أو ما يقرب من كل محتوى السائل في المستخلص، أو أي شكل آخر. بشكل عام، قد تختلف طرق استخراج المواد مع مراعاة ما يلي اعتمادًا على عمر ثمرة المارولا، والنوع الفرعي، وموسم الحصاد، ومنطقة النمو، والمواد التي يجب استخراجها، واستقرارها وعوامل أخرى معروفة لشخص ماهر في هذا المجال.

في بعض التجسيدات، يتم الحصول على مستخلص الاختراع عن طريق ملامسة عصير المارولا مع محلول مائي لاستخراج مكون واحد أو أكثر أو مزيج منها منه. قد يكون "المحلول المائي" في معظم المصطلحات العامة عبارة عن ماء (في بعض التجسيدات ماء بتركيزات معدنية طبيعية متفاوتة) أو ماء مقطر أو منقى بطريقة أخرى (مقطر أو منقى بأي طريقة أخرى)، أو محلول ملح مائي يشتمل على ملح واحد أو أكثر أو خليط من الماء مع مذيب قطبي واحد أو أكثر قابل للامتزاج بالماء، على سبيل المثال، _{C1 -C4} الكحولات والكيتونات.

في بعض التجسيدات، يكون المذيب المائي عبارة عن خليط من الماء وكحول واحد على الأقل. وفي بعض التجسيدات الإضافية، يكون المذيب المائي عبارة عن خليط من الماء والإيثانول، حيث تكون نسبة الماء:الإيثانول واحدة من 1:1، 1:2. . . 1:5. . . 1:10. . . 1:100. . . 1:1000. . . إلخ، على التوالي، أو 2:1، 3:1. . . 5:1. . . 10:1. . . 100:1. . . 1000:1، وما إلى ذلك، على التوالي. يتم أيضًا تضمين أي نسبة وسيطة أخرى.

يمكن أن يتم الاستخلاص باستخدام مذيب عضوي بمفرده أو بالاشتراك مع مذيب آخر. في بعض التجسيدات، تكون عملية الاستخلاص عبارة عن عملية متعددة الخطوات حيث يتم ملامسة ثمرة المارولا (العصير) أولاً بمذيب واحد ثم بمذيب مختلف وذلك لتعظيم العائد أو إثراء المستخلص بمكون واحد أو أكثر مرغوب فيه.

عادةً ما يكون المذيب العضوي عبارة عن كحول واحد على الأقل مثل الميثانول والإيثانول والكحول الأيزوبروبيل، أو الكيتون مثل الأسيتون. عند استخدام الإيثانول، يمكن استخدامه كمحلول إيثانولي مائي، على سبيل المثال، ما بين حوالي 40 إلى 60% من الإيثانول. يمكن أيضًا استخدام حلول مماثلة مع مذيبات عضوية أخرى قابلة للامتزاج بالماء. المستخلص الذي تم الحصول عليه من المستخلص الكحولي التالي يسمى هنا المستخلص الأول.

يجب أن يكون مفهوما في سياق الاختراع الحالي أن الاستخلاص الإيثانولي، أو أي استخلاص آخر تم الكشف عنه هنا، يمكن أن يتم في أي درجة حرارة مناسبة. وسوف يكون واضحا لأولئك المهرة في هذا الفن أن الاستخلاص الأكثر كفاءة سيحدث إذا تم تحريك العصير، مثل التحريك أو الرج، و/أو إذا تم تسخين الخليط إلى درجة حرارة أعلى من درجة حرارة الغرفة (أعلى من 25-27 درجة مئوية). يمكن أيضًا استخدام درجات حرارة استخلاص أقل، مثل تلك التي تكون أقل من درجة حرارة الغرفة. وفي بعض التجسيدات، تتم عملية الاستخلاص عند درجة حرارة الغرفة أو عند درجة حرارة تتراوح بين 25 و30 درجة مئوية.

ويجب أن يكون مفهوما أيضا في سياق الاختراع الحالي أن عملية الاستخراج يمكن أن تتم لأي فترة زمنية مناسبة.

كما أن الشخص الماهر في هذا المجال سوف يدرك أن عملية الحصول على مستخلص الاختراع قد تتضمن نقع ثمرة المارولا للحصول على أجزاء أصغر من الفاكهة الكاملة والتي يمكن الحصول على المستخلصات منها بواسطة طريقة أو أكثر من طرق الاستخراج الأخرى، مثل التقطير. وبدلا من ذلك، يمكن الحصول على المستخلص عن طريق التعبير، أي عن طريق استخراج العصير من الفاكهة.

وهكذا، في بعض الصيغ التنفيذية، قبل ملامسة العصير لمذيب واحد أو أكثر كما هو موضح، يمكن معالجة الفاكهة، أي الفاكهة الكاملة، باستثناء البذور، أو أي جزء منها، مسبقًا عن طريق النقع أو العصر أو أي عملية أخرى.

يمكن تخزين العصير الذي يتم الحصول عليه من ثمار المارولا قبل الاستخلاص أو المعالجة الأولية، على سبيل المثال، التجفيف، لفترات طويلة من الزمن. يمكن أن يتم التخزين عند أي درجة حرارة وأي ظروف، بحيث يتم الحفاظ على نضارة العصير ومنع التحلل أو تقليله إلى الحد الأدنى. قد تكون هذه درجات الحرارة أعلى أو أقل من درجة حرارة الغرفة. في بعض التجسيدات، قد يتم تخزين العصير في الثلاجة لعدة أسابيع أو في الفريزر لعدة سنوات. في حالة استخدام تجميد العصير، قد تتضمن العملية أيضًا خطوة إذابة العصير قبل الاستخراج أو المعالجة.

يمكن تجفيف العصير عن طريق تسخين العصير السائل تحت الفراغ، أو تحت الضغط الجوي، عند درجة حرارة محددة مسبقًا والتي قد تكون درجة حرارة الغرفة أو أعلى من درجة الحرارة المحيطة، في دفعة واحدة أو بكميات أصغر وذلك للتحكم في محتوى الرطوبة في المستخلص. في مثال غير مقيد تم الكشف عنه هنا، يتم تحقيق التجفيف عن طريق سكب العصير على سطح مثل صينية، وفي بعض الحالات مغطاة بورق قصدير (على سبيل المثال، ورق ألمنيوم) لتسخين العصير بالتساوي والحصول على طبقة موحدة إلى حد كبير من مستخلص المارولا المجفف.

المركز الرطب (الشراب) الذي يتم الحصول عليه عن طريق التجفيف يكون لونه مائل إلى الأصفر إلى البني الداكن، وذلك حسب التركيز ونوع المستخلص. يتم سحق المادة المجففة بسهولة ولها لون ذهبي لامع إلى بني غامق اعتمادًا على نوع المستخلص. المادة المجففة قابلة للذوبان في الماء.

يحتوي مستخلص المارولا الذي يتم الحصول عليه لاحقًا على كميات متفاوتة من المواد المتطايرة، حيث تعتمد الكميات على طول فترة التجفيف ودرجة الحرارة المستخدمة. دون الرغبة في الالتزام بالنظرية، عند إزالة المكونات المتطايرة، يحتوي التركيز، وبالتحديد في بعض التجسيدات، المستخلص المسحوق، مقارنة بعصير الفاكهة الكامل على تركيز أعلى من المكونات النشطة التي يوفر وجودها وتركيبها النشاط العالي الذي لا يُلاحظ في الفاكهة الكاملة والذي تم إثباته هنا.

وبالتالي، يتم الحصول على المستخلص من خلال عملية تتضمن ملامسة عصير المارولا مع مذيب مائي كما هو محدد للحصول على معلق يمكن فصل مستخلص سائل منه.

في بعض التجسيدات، تتضمن العملية ما يلي:

في بعض التجسيدات، يتم تجفيف العصير المجمع أو معالجته مسبقًا كما هو موضح قبل الاستخراج.

وفي تجسيدات أخرى، قد يتم فصل المستخلص السائل للخطوة (ثالثًا) عن طريق الطرد المركزي للمعلق الذي تم الحصول عليه في الخطوة (ثانيًا) لفصل المستخلص السائل كسائل علوي عن كتلة صلبة.

وفي بعض التجسيدات الإضافية، تتضمن العملية ما يلي:

وفي تجسيدات أخرى، تتضمن العملية ما يلي:

وفي بعض التجسيدات الأخرى، تتضمن العملية ما يلي:

تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تكرار فصل المستخلص السائل أكثر من مرة، بكمية ثانية من نفس المذيب أو مذيب مختلف، ويمكن دمج الرواسب العلوية التي تم الحصول عليها من كل خطوة ومعالجتها بشكل أكبر لعزل المستخلص أو تركيزه أو معالجته بشكل أكبر. وبالتالي، من الممكن دمج اثنين أو أكثر من الرواسب العلوية وإزالة المذيب و/أو بعض الماء، على سبيل المثال باستخدام أي طريقة من طرق إزالة المذيب.

عندما تتضمن مادة الفاكهة الأولية مادة صلبة أو في الحالات التي تمت فيها معالجة فاكهة المارولا إلى مسحوق مجفف أو نصف مجفف أو شكل حبيبي، يمكن فصل المستخلص على الأقل إلى مرحلة صلبة ومرحلة مائية، حيث يكون لكل مرحلة النشاط البيولوجي كما هو موضح هنا.

يمكن أن يتميز مستخلص الاختراع، الذي يتم الحصول عليه باستخدام عملية واحدة أو أكثر كما هو موضح هنا، بواحد أو أكثر من الخصائص التالية:

وبالتالي، يوفر الاختراع أيضًا مستخلص المارولا الذي يتميز بقدرة مضادة للأكسدة FRAP بما لا يقل عن 1000 و1500 ملغ من مكافئ فيتامين سي لكل 100 مل. يُقارن هذا بـ FRAP المقاس لعصير المارولا غير المعالج والذي يتراوح بين 260 و 600 ملغ من فيتامين سي لكل 100 مل. وبعبارة أخرى، فإن سعة FRAP للمستخلص وفقًا للاختراع تتراوح بين 2 إلى 3 أضعاف النشاط الملحوظ في العصير الأصلي غير المعالج.

في بعض التجسيدات، يكون المستخلص الذي يتمتع بسعة FRAP المذكورة أعلاه هو المستخلص I.

يوفر الاختراع الحالي أيضًا مستخلصًا يحتوي على جزء متعدد الفينول مستنفد، حيث يتم تسمية المستخلص المذكور هنا باسم المستخلص II. يمكن فصل الجزء متعدد الفينول، المشار إليه هنا باسم المستخلص الثالث، عن عصير المارولا، على سبيل المثال، عن طريق كروماتوغرافيا عصير المارولا للحصول على المستخلص الثاني (المستنفد) والمستخلص الثالث (الجزء الفينولي المنفصل). في بعض الصيغ التجسيدية، يتم تحقيق استنزاف جزء البوليفينول من خلال عملية تتضمن ترشيح عصير المارولا، على سبيل المثال عن طريق تمرير العصير من خلال طبقة واحدة أو أكثر من القماش القطني (من درجات مختلفة، على سبيل المثال، من النسيج المفتوح إلى النسيج فائق الدقة المستخدم وفقًا لجودة وكمية العصير)، واختياريا طرد مركزي للعصير المفلتر لإزالة حطام الفاكهة، وتطبيق العصير الصافي على الكروماتوغرافيا، على سبيل المثال، كروماتوغرافيا العمود باستخدام أعمدة معبأة بتبادل الأيونات Sepabeads وراتنجات الماصة، أو السيليكا المرتبطة بـ _C18 أو الراتنجات للتفاعل الكاره للماء وكروماتوغرافيا الطور العكسي، وجمع الكسور ودمج الكسور التي لها نفس المواد الصلبة الذائبة الكلية (TSS).

في بعض التجسيدات، يمكن جمع جزء البوليفينول من الوسط المستخدم للكروماتوغرافيا، على سبيل المثال، من خرز العمود، عن طريق خلط الوسط، على سبيل المثال، الخرز، مع محلول كحولي (إيثانول، ميثانول، إلخ). يمكن بعد ذلك دمج المكونات الكحولية وتبخيرها حتى الجفاف.

وفقًا لبعض التجسيدات، من أجل الحصول على مستخلص بنسبة بوليفينول:فيتامين سي متزايدة، قد يتم فصل جزء البوليفينول (أي المستخلص الثالث) عن العصير ثم إضافته إلى الجزء الخالي من البوليفينول (أي المستخلص الثاني). في بعض التجسيدات الأخرى، يتم دمج المستخلص الثاني مع المستخلص الأول.

في بعض التجسيدات، يتميز المستخلص الثاني بقدرة مضادة للأكسدة FRAP تتراوح على الأقل بين 250 و500 ملغ من مكافئ فيتامين سي لكل 100 مل.

كما هو مستخدم هنا، يشير مصطلح "البوليفينول" إلى مجموعة من المواد، تتميز بوجود أكثر من وحدة فينول أو كتلة بناء لكل جزيء. تنقسم البوليفينولات بشكل عام إلى تانينات قابلة للتحلل المائي (إسترات حمض الغال للجلوكوز والسكريات الأخرى) وفينيل بروبانويدات، مثل اللجنين والفلافونويد والتانينات المكثفة. في بعض التجسيدات، تشتمل البوليفينولات التي يتم الحصول عليها من عصير البقعة الصفراء على تانينات قابلة للتحلل المائي وكيتشينات وأحماض هيدروكسي سيناميك و/أو مشتقاتها.

وفي جانب آخر من جوانبها، توفر الاختراع الحالي استخدام مستخلص واحد على الأقل من الاختراع لإعداد تركيبة.

في بعض التجسيدات، تكون التركيبة عبارة عن تركيبة صيدلانية.

وفي تجسيدات أخرى، يكون المستخلص هو المكون النشط الموجود في التركيبة إلى جانب حامل أو مخفف أو مادة مساعدة مقبولة صيدلانيًا.

سيتم تحديد اختيار الناقل جزئيًا من خلال المستخلص المحدد، بالإضافة إلى الطريقة المحددة المستخدمة لإدارة التركيبة المكونة له. وبناءً على ذلك، هناك مجموعة واسعة من الصيغ المناسبة للتركيبة الصيدلانية للاختراع الحالي. التركيبات التالية للإعطاء عن طريق الفم، والرذاذ، والحقن، وتحت الجلد، والوريد، والعضلي، والصفاق، والمستقيم، والمهبل هي مجرد أمثلة وليست مقيدة بأي حال من الأحوال.

يمكن أن تتكون التركيبات المناسبة للإعطاء عن طريق الفم من (أ) محاليل سائلة، مثل كمية فعالة من المستخلص مذابة في مخففات، مثل الماء، أو المحلول الملحي، أو عصير البرتقال؛ (ب) الكبسولات والأكياس والأقراص والحبوب والحلوى، كل منها يحتوي على كمية محددة مسبقًا من المستخلص، على شكل مواد صلبة أو حبيبات؛ (ج) المساحيق؛ (د) المعلقات في سائل مناسب؛ و(هـ) المستحلبات المناسبة. قد تتضمن المستحضرات السائلة مخففات مثل الماء والكحوليات، على سبيل المثال الإيثانول، والكحول البنزيلي، والكحوليات البولي إيثيلينية، إما مع أو بدون إضافة مادة فعالة سطحية مقبولة صيدلانيًا، أو عامل تعليق، أو عامل مستحلب. يمكن أن تكون أشكال الكبسولات من النوع العادي من الجيلاتين ذي القشرة الصلبة أو اللينة التي تحتوي، على سبيل المثال، على مواد فعالة بالسطح ومواد تشحيم وحشوات خاملة، مثل اللاكتوز والسكروز وفوسفات الكالسيوم ونشا الذرة. يمكن أن تتضمن أشكال الأقراص واحدًا أو أكثر من اللاكتوز والسكروز والمانيتول ونشا الذرة ونشا البطاطس وحمض الألجينيك والسليلوز الجريزوفولفين والأكاسيا والجيلاتين وصمغ الغوار وثاني أكسيد السيليكون الغرواني وكروس كارميلوز الصوديوم والتلك وستيرات المغنيسيوم وستيرات الكالسيوم وستيرات الزنك وحمض دهني ومواد مساعدة أخرى ومواد ملونة ومخففة وعوامل تخزين وعوامل تفكك وعوامل ترطيب ومواد حافظة وعوامل نكهة وناقلات متوافقة دوائيًا. يمكن أن تشتمل أشكال أقراص الاستحلاب على المادة الفعالة في النكهة، وعادة ما تكون السكروز والسنط أو الصمغ العربي، وكذلك أقراص الاستحلاب التي تشتمل على المادة الفعالة في قاعدة خاملة، مثل الجيلاتين والجلسرين، أو السكروز والسنط، والمستحلبات، والمواد الهلامية، وما شابه ذلك التي تحتوي، بالإضافة إلى المستخلص، على مثل هذه الناقلات المعروفة في هذا المجال.

يمكن تحويل المستخلصات أو التركيبات الخاصة بالاختراع الحالي، على سبيل المثال التركيبة الصيدلانية، بمفردها أو بالاشتراك مع مكونات أخرى مناسبة، إلى تركيبات رذاذ يتم إعطاؤها عن طريق الاستنشاق. يمكن وضع تركيبات الهباء الجوي هذه في الوقود المضغوط المقبول، مثل ثنائي كلورو ثنائي فلورو الميثان، والبروبان، والنيتروجين، وما شابه ذلك. يمكن أيضًا صياغتها كمستحضرات صيدلانية لمستحضرات غير مضغوطة، مثل جهاز الاستنشاق أو التبخير.

تشتمل التركيبات المناسبة للإعطاء عن طريق الحقن على محاليل حقن معقمة متساوية التوتر، مائية وغير مائية، يمكن أن تحتوي على مضادات الأكسدة، والمحاليل العازلة، والمواد المذيبة، والمذيبات التي تجعل التركيبة متساوية التوتر مع دم المتلقي المقصود، والمعلقات المعقمة المائية وغير المائية التي تتضمن عوامل تعليق، ومذيبات، وعوامل تكثيف، ومثبتات، ومواد حافظة. يمكن إعطاء المركب في مخفف مقبول فسيولوجيًا في حامل صيدلاني، مثل سائل معقم أو خليط من السوائل، بما في ذلك الماء والمحلول الملحي والدكستروز المائي ومحاليل السكر ذات الصلة، أو الكحول، مثل الإيثانول أو الأيزوبروبانول أو كحول سداسي الديسيل، أو الجليكول، مثل البروبيلين جليكول أو بولي إيثيلين جليكول، أو كيتالات الجلسرين، مثل 2،2- ثنائي ميثيل-1،3- ديوكسولان-4- ميثانول، أو الإيثرات، مثل بولي (إيثيلين جليكول) 400، أو الزيت، أو الحمض الدهني، أو إستر أو جلسريد الأحماض الدهنية، أو جلسريد الأحماض الدهنية الأسيتيل مع أو بدون إضافة مادة فعالة سطحية مقبولة صيدلانيًا، مثل الصابون أو المنظفات، أو عامل تعليق، مثل البكتين، أو الكاربوميرات، أو ميثيل السليلوز، أو هيدروكسي بروبيل ميثيل السليلوز، أو كربوكسي ميثيل السليلوز، أو عوامل الاستحلاب والمواد المساعدة الصيدلانية الأخرى.

تشمل الزيوت التي يمكن استخدامها في التركيبات الوريدية الزيوت البترولية، أو الحيوانية، أو النباتية، أو الاصطناعية. وتشمل الأمثلة المحددة للزيوت زيت الفول السوداني وفول الصويا والسمسم وبذرة القطن والذرة والزيتون والفازلين والمعادن. تشمل الأحماض الدهنية المناسبة للاستخدام في التركيبات الوريدية حمض الأوليك وحمض الاستاريك وحمض الإيزوستياريك. يعتبر إيثيل أوليت وميريستات الأيزوبروبيل من الأمثلة على إسترات الأحماض الدهنية المناسبة. تشمل الصابونات المناسبة للاستخدام في التركيبات الوريدية أملاح المعادن القلوية الدهنية والأمونيوم وثلاثي إيثانول أمين، وتشمل المنظفات المناسبة (أ) المنظفات الكاتيونية مثل، على سبيل المثال، هاليدات ثنائي ميثيل ثنائي ألكيل الأمونيوم، وهاليدات ألكيل بيريدينيوم، (ب) المنظفات الأنيونية مثل، على سبيل المثال، ألكيل وأريل وأوليفين سلفونات، ألكيل وأوليفين وإيثر وكبريتات أحادي الجليسريد، وسلفوسكسينات، (ج) المنظفات غير الأيونية مثل، على سبيل المثال، أكاسيد الأمين الدهنية، وألكانولاميدات الأحماض الدهنية، وبولي أوكسي إيثيلين بولي بروبيلين كوبوليمرات، (د) المنظفات الأمفوترية مثل، على سبيل المثال، ألكيل-β-أمينوبروبيونات، وأملاح رباعي الأمونيوم 2-ألكيل-إيميدازولين، و(3) مخاليط منها.

تحتوي المستحضرات الوريدية عادة على ما بين حوالي 0.5 إلى حوالي 25% من وزن المستخلص في المحلول. يمكن استخدام المواد الحافظة والمحاليل المناسبة في مثل هذه التركيبات. من أجل تقليل أو القضاء على التهيج في موقع الحقن، قد تحتوي هذه التركيبات على واحد أو أكثر من المواد الخافضة للتوتر السطحي غير الأيونية ذات التوازن المحب للماء والمحب للدهون (HLB) من حوالي 12 إلى حوالي 17. تتراوح كمية المادة الخافضة للتوتر السطحي في مثل هذه التركيبات من حوالي 5 إلى حوالي 15% بالوزن. تشتمل المواد الخافضة للتوتر السطحي المناسبة على إسترات الأحماض الدهنية بولي إيثيلين سوربيتان، مثل أحادي أوليات السوربيتان ومشتقات أكسيد الإيثيلين ذات الوزن الجزيئي العالي مع قاعدة كارهة للماء، والتي تتشكل عن طريق تكثيف أكسيد البروبيلين مع البروبيلين جليكول. يمكن تقديم المستحضرات الوريدية في حاويات محكمة الغلق ذات جرعة واحدة أو جرعات متعددة، مثل الأمبولات والقوارير، ويمكن تخزينها في حالة مجففة بالتجميد (مجففة بالتجميد) تتطلب فقط إضافة حامل سائل معقم، على سبيل المثال، الماء، للحقن، مباشرة قبل الاستخدام. يمكن تحضير المحاليل والمعلقات للحقن الفوري من مساحيق وحبيبات وأقراص معقمة من النوع الموصوف سابقًا.

يمكن تحويل المستخلصات والتراكيب الخاصة بالاختراع الحالي إلى تركيبات قابلة للحقن. إن متطلبات الحاملات الصيدلانية الفعالة للتركيبات القابلة للحقن معروفة جيدًا لأولئك ذوي المهارة العادية في هذا المجال. يرى الصيدلة وممارسة الصيدلة، شركة جيه بي ليبينكوت، فيلادلفيا، بنسلفانيا، بانكر وتشالمرز، المحررون، الصفحات 238-250 (1982)، و دليل الجمعية الأمريكية لممارسي الصيدلة (ASHP) بشأن المخدرات القابلة للحقن، تويسل، ^الرابع المحرر، الصفحات 622-630 (1986).

بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحويل مستخلصات الاختراع الحالي إلى تحاميل عن طريق الخلط مع مجموعة متنوعة من القواعد، مثل القواعد المستحلبة أو القواعد القابلة للذوبان في الماء. يمكن تقديم التركيبات المناسبة للإعطاء المهبلي على شكل تحاميل أو سدادات قطنية أو كريمات أو مواد هلامية أو معاجين أو رغاوي أو تركيبات رذاذ تحتوي، بالإضافة إلى المادة الفعالة، على حاملات معروفة في المجال بأنها مناسبة.

كما ذكر أعلاه، يمكن تصنيع المستخلصات والتراكيب الخاصة بالاختراع وتقديمها و/أو تخزينها في أي شكل، أي في شكل سائل أو مركز أو مسحوق جاف أو محلول أو مستحلب أو محلول مخزن أو مركز مخزن.

في بعض التجسيدات، تكون التركيبة الدوائية مخصصة لعلاج أو الوقاية من مرض أو اضطراب واحد على الأقل مرتبط بأضرار الإجهاد التأكسدي.

الإجهاد التأكسدي هو نتيجة اختلال التوازن في التوازن المؤكسد/المضاد للأكسدة مما يؤدي إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية السامة. تتشكل الجذور الحرة عندما يتفاعل الأكسجين مع جزيئات معينة ويبدأ سلسلة من ردود الفعل الضارة بين المكونات الخلوية المهمة. وهكذا، فإن العمليات الالتهابية والأكسدة مترابطة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للإجهاد التأكسدي أن يحفز السمية الخلوية لخلايا الدم، ويحفز إطلاق السيتوكينات الالتهابية، ويحفز إنتاج عوامل النمو. يلعب الإجهاد التأكسدي دورًا حاسمًا في تكوين اللويحات، وقد يكون، إلى جانب الالتهاب الوعائي المتأصل، مؤشرًا قويًا لتصلب الشرايين.

وهكذا، وكما هو مستخدم هنا، يشير "ضرر الإجهاد التأكسدي" إلى الضرر الذي يلحق بخلايا وأنسجة و/أو أعضاء حيوان، بما في ذلك البشر، والذي يحدث بسبب اختلال التوازن بين إنتاج الأكسجين التفاعلي وقدرة النظام البيولوجي على إزالة السموم من الوسائط التفاعلية بسهولة أو إصلاح الضرر الناتج بسهولة. في أغلب الأحيان، قد تؤدي الاضطرابات في حالة الأكسدة والاختزال الطبيعية هذه إلى تأثيرات سامة من خلال إنتاج البيروكسيدات والجذور الحرة التي تلحق الضرر بجميع أو بعض مكونات الخلية، بما في ذلك البروتينات والدهون والحمض النووي.

في بعض التجسيدات، يرتبط الضرر الناجم عن الإجهاد التأكسدي باضطراب أو مرض مختار من بين تصلب الشرايين، ومرض باركنسون، وفشل القلب، واحتشاء عضلة القلب، والأمراض أو الاضطرابات العصبية التنكسية، وأمراض العين، ومتلازمة التعب المزمن وغيرها.

يعد تصلب الشرايين السبب الرئيسي للإصابة والوفاة بين الأشخاص الذين يتبعون أسلوب حياة غربي، ويتطور نتيجة لعوامل خطر مختلفة. ارتفاع الكوليسترول في الدم هو عامل خطر رئيسي لتصلب الشرايين، وانخفاض تركيز الكوليسترول في البلازما عن طريق العلاج الدوائي يقلل من حدوث أمراض القلب والأوعية الدموية. تتميز الآفة التصلبية الشريانية بالإجهاد التأكسدي المتسارع وتكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، التي تهاجم الدهون في البروتينات الدهنية، وكذلك في الخلايا البلعمية الشريانية. يلعب التعديل التأكسدي للبروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) دورًا رئيسيًا في التسبب في تصلب الشرايين. يعتبر البروتين الدهني منخفض الكثافة المؤكسد (Ox-LDL) مساهمًا رئيسيًا في تطور الآفات التصلبية، لأنه يحفز تراكم الكوليسترول في الخلايا البلعمية وتكوين الخلايا الرغوية. على النقيض من تأثير البروتين الدهني منخفض الكثافة على تصلب الشرايين، فإن مستويات البروتين الدهني عالي الكثافة في المصل ترتبط عكسيا بخطر الإصابة بتصلب الشرايين. يمارس البروتين الدهني عالي الكثافة تأثيرًا مثبطًا على أكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة وقد يكون هذا التأثير مرتبطًا بالإنزيم المرتبط به الباراوكسوناز 1 (PON1).

تصلب الشرايين هو أيضًا العملية أو الاضطراب الذي ينطوي على تراكم اللويحات على الجانب الداخلي من الشرايين، بما في ذلك تلك الموجودة في القلب والدماغ والذراعين والساقين والحوض. وبالتالي، قد يشير المصطلح أيضًا إلى التراكم التدريجي لخلايا العضلات الملساء، والخلايا المناعية (مثل الخلايا الليمفاوية، أو الخلايا البلعمية، أو الخلايا الوحيدة)، والمنتجات الدهنية (مثل البروتينات الدهنية، أو الكوليسترول)، ومنتجات النفايات الخلوية، والكالسيوم، أو مواد أخرى داخل البطانة الداخلية للشريان، مما يؤدي إلى تضييق أو انسداد الأوعية الدموية وتطور الأمراض المرتبطة بتصلب الشرايين.

وبما أن تصلب الشرايين يظهر في الشرايين الكبيرة والمتوسطة الحجم، فإن العلاج أو الوقاية غالباً ما يؤثر على تطور حالة من الالتهاب المزمن داخل الشرايين.

لذلك فإن مستخلص الاختراع مناسب أيضًا لعلاج والوقاية من الحالات بما في ذلك تصلب الشرايين التاجية المسببة لأمراض الشريان التاجي واحتشاء عضلة القلب والجلطات التاجية والذبحة الصدرية؛ تصلب الشرايين التي تغذي الجهاز العصبي المركزي مما يسبب السكتات الدماغية ونقص تروية الدماغ العابر؛ تصلب الشرايين في الدورة الدموية الطرفية مما يسبب العرج المتقطع والغرغرينا؛ تصلب الشرايين في أحد شرايين الدورة الدموية الحشوية مما يسبب نقص تروية المساريقا؛ و تضيق الشريان الكلوي.

وبالتالي، فإن تركيبة الاختراع مناسبة أيضًا للاستخدام في علاج أو الوقاية من مرض أو اضطراب واحد على الأقل مرتبط بواحد أو أكثر من تركيزات الدهون الثلاثية في مصل الدم المرتفعة، وتركيزات الكوليسترول في مصل الدم وتركيزات الكوليسترول الكلي والضار في مصل الدم، وانخفاض تركيزات الكوليسترول الحميد.

على النحو المستخدم هنا، فإن مثل هذا المرض أو الاضطراب المرتبط بزيادة تركيزات الدهون الثلاثية في مصل الدم وتركيزات الكوليسترول في مصل الدم وتركيزات الكوليسترول الكلي والضار في مصل الدم وانخفاض تركيزات الكوليسترول الحميد، ينطوي على مستويات عالية بشكل غير طبيعي من الكوليسترول (فرط كوليسترول الدم)، و/أو مستويات عالية من LDL أو الدهون الثلاثية و/أو تركيزات أقل من HDL الوظيفي، مثل مرض القلب التاجي أو أشكال أخرى من أمراض القلب والأوعية الدموية وكذلك الأمراض أو الاضطرابات التي تنطوي على تطور تصلب الشرايين (أي تصلب الشرايين)، مثل نقص كوليسترول الدم وأمراض الأوعية الدموية الطرفية والسكري وارتفاع ضغط الدم.

وقد تم ربط الإجهاد التأكسدي أيضًا بموت الخلايا العصبية المرتبط بمختلف الحالات العصبية التنكسية. الأمراض العصبية التنكسية هي الحالات التي يتم فيها فقدان خلايا الدماغ والحبل الشوكي. عادة، يبدأ التنكس العصبي قبل وقت طويل من ظهور أي أعراض على المريض. وبما أن خلايا المخ تتعرض بشكل مستمر لجزيئات الأكسجين التفاعلية التي تولدها عملية التمثيل الغذائي التأكسدي، فإن الإجهاد التأكسدي يعد أيضًا أحد العوامل المهيئة للاضطرابات العصبية لدى البالغين، وقد ثبت أنه متورط في التسبب في بعض هذه الاضطرابات مثل مرض باركنسون.

ويستخدم المستخلص أو التركيبة المذكورة في الاختراع أيضًا لعلاج أو الوقاية من مرض أو اضطراب عصبي تنكسي واحد على الأقل.

تشير "الأمراض أو الاضطرابات العصبية التنكسية"، في سياق الاختراع الحالي، إلى حالة واحدة أو أكثر يتم فيها فقدان خلايا الدماغ والحبل الشوكي نتيجة لتدهور الخلايا العصبية أو غلاف الميالين الخاص بها مما يؤدي بمرور الوقت إلى خلل وإعاقات ناتجة عن ذلك. وبالتالي، فإن الأمراض أو الاضطرابات العصبية التنكسية هي تلك التي تتعلق بالحالات التي تسبب مشاكل في الحركة، مثل الرنح، وكذلك الحالات التي تؤثر على الذاكرة والمرتبطة بالخرف. بعض الأمثلة غير المحدودة للأمراض التنكسية العصبية أو الاضطرابات تشمل إدمان الكحول ، ومرض ألكساندر ، ومرض Alper ، ومرض الزهايمر ، والتصلب الجانبي الضموري (مرض Lou Geerig) ، ومرض الباتغين ، ensephine شلل Bral ، متلازمة Cockayne ، تنكس القشرية ، Creutzfeldt-Jakob ، تنكس الفص الجبهي ، مرض هنتنغتون ، مرض عازف فيروس العصب ، مرسى عظم ، krabbe Arcolepsy ، Niemann Pick Disease ، مرض الشلل الرعاش ، مرض بيليزايوس-ميرازباتشر ، مرض بيك ، التصلب الجانبي الأولي ، أمراض بريون ، الشلل فوق النوى التدريجي ، مرض الحكام ، مرض ساندهوفز ، مرض تشيليدر ، التنكس المشترك شبه الحاد للحبل الشوكي الثانوي لفقر الدم الخبيث، وخلل التنسج المخيخي، وضمور العضلات الشوكي، ومرض ستيل ريتشاردسون أولزيوسكي، والتابس الظهري.

في جانب آخر من جوانبها، توفر الاختراع الحالي طريقة لعلاج أو منع مرض أو اضطراب واحد على الأقل مرتبط بأضرار الإجهاد التأكسدي في الثدييات، وتشتمل على إعطاء الثدييات المذكورة كمية فعالة من المستخلص وفقًا للاختراع أو تركيبة صيدلانية مكونة منه.

في جانب إضافي من الاختراع الحالي، يتم توفير طريقة لعلاج أو منع مرض أو اضطراب واحد على الأقل مرتبط بواحد أو أكثر من تركيزات الدهون الثلاثية في مصل الدم المرتفعة، وتركيزات الكوليسترول في مصل الدم وتركيزات الكوليسترول الكلي والضار في مصل الدم وتركيزات الكوليسترول الحميد المنخفضة في مصل الدم في الثدييات، وتشتمل على إعطاء الثدييات المذكورة كمية فعالة من المستخلص وفقًا للاختراع أو تركيبة صيدلانية مكونة منه.

في جانب آخر من جوانبها، توفر الاختراع الحالي طريقة لعلاج أو منع مرض أو اضطراب عصبي تنكسي واحد على الأقل في الثدييات، وتشتمل على إعطاء الثدييات كمية فعالة من مستخلص وفقًا للاختراع أو تركيبة صيدلانية مكونة منه.

وفي جانب آخر، يوفر الاختراع الحالي مضادًا للأكسدة يشتمل على مستخلص الاختراع.

وفي جانب آخر، يوفر الاختراع الحالي عاملًا لخفض الكوليسترول يشتمل على مستخلص الاختراع.

في نطاق الاختراع الحالي، يشير مصطلح "علاج و/أو منع" إلى إعطاء كمية علاجية من تركيبة الاختراع الحالي والتي تكون فعالة في تحسين الأعراض غير المرغوب فيها المرتبطة بمرض ما، أو منع ظهور هذه الأعراض قبل حدوثها، أو إبطاء تقدم المرض، أو إبطاء تدهور الأعراض، أو تعزيز بداية فترة الهدوء، أو إبطاء الضرر غير القابل للإصلاح الذي يحدث في المرحلة المزمنة التقدمية من المرض، أو تأخير بداية هذه المرحلة التقدمية، أو تقليل شدة المرض أو علاجه، أو تحسين معدل البقاء على قيد الحياة أو التعافي بشكل أسرع، أو منع حدوث شكل المرض أو مزيج من اثنين أو أكثر من الأشكال المذكورة أعلاه.

يمكن إعطاء مستخلص أو تركيبة من الاختراع بأي طريقة معروفة لشخص متخصص في هذا المجال. عادةً ما تكون إدارة المستخلص أو التركيبة الصيدلانية المكونة منه عبارة عن كمية فعالة من المستخلص (المستخلصات) المتضمنة في التركيبة. يتم تحديد "المبلغ الفعال" للأغراض الواردة هنا من خلال الاعتبارات المعروفة في هذا المجال. ويجب أن تكون الكمية فعالة لتحقيق التأثير العلاجي المطلوب كما هو موضح أعلاه، وذلك اعتمادًا، من بين أمور أخرى، على نوع وشدة المرض الذي يجب علاجه ونظام العلاج. يتم تحديد الكمية الفعالة عادة في التجارب السريرية المصممة بشكل مناسب (على سبيل المثال، دراسات نطاق الجرعة) وسوف يعرف الشخص الماهر في هذا المجال كيفية إجراء مثل هذه التجارب بشكل صحيح من أجل تحديد الكمية الفعالة. كما هو معروف بشكل عام، تعتمد الكمية الفعالة على مجموعة متنوعة من العوامل بما في ذلك مدى تقارب الربيطة مع المستقبل، ونمط توزيعها داخل الجسم، ومجموعة متنوعة من المعايير الدوائية مثل نصف العمر في الجسم، والآثار الجانبية غير المرغوب فيها، إن وجدت، وعوامل مثل العمر والجنس، إلخ.

يمكن أيضًا استخدام مستخلص الاختراع لإعداد تركيبة للاستخدام في مجموعة متنوعة من التطبيقات غير الصيدلانية. في بعض التجسيدات، تكون التركيبة عبارة عن تركيبة مضادة للأكسدة لاستخدامها كمواد حافظة لمجموعة واسعة من التطبيقات في صناعة الأغذية، وصناعة مستحضرات التجميل، والعلاجات، وما إلى ذلك، ولمنع أكسدة LDL المستحثة بواسطة أيونات النحاس في المختبر أو في الجسم الحي.

يمكن أيضًا استخدام المستخلص الموضح هنا كمكمل غذائي أو كمكون نشط لمثل هذا المكمل. في بعض التجسيدات، يكون المكمل مناسبًا للاستهلاك من قبل البشر والحيوانات غير البشرية، لإدارة الرفاهية، وعلاج والوقاية من الحالات والاضطرابات المرتبطة بالضرر التأكسدي.

في سياق الاختراع الحالي، قد يشتمل المكمل الغذائي، اعتمادًا على طبيعته وشكلها الفيزيائي، مثل الطبيعة المحبة للدهون أو المحبة للماء، على واحد أو أكثر من المستحلبات والمثبتات ومضادات الأكسدة والمواد المضافة الأخرى. يتم استخدام المستحلبات المتوافقة مع الأغذية، مثل الفسفوليبيدات، على سبيل المثال الليسيثين، بولي أوكسي إيثيلين سوربيتان أحادي أو ثلاثي ستيرات، مونو لورات، مونو بالميتات، أحادي أو ثلاثي أوليات، أحادي أو ثنائي الجليسريد. يمكن إضافة هذه المستحلبات والمثبتات ومضادات الأكسدة والمواد المضافة إلى مستخلص الاختراع وفقًا للاستخدام النهائي لهذا المستخلص.

قد يحتوي المكمل الغذائي الموضح هنا أيضًا على مواد حيوية صناعية أو طبيعية مثل الأحماض الأمينية والأحماض الدهنية والفيتامينات والمعادن والبوليفينول وما إلى ذلك، والتي يمكن إضافتها إما عن طريق الخلط الجاف أو الرطب إلى التركيبة المذكورة قبل البسترة و/أو التجفيف.

في بعض التجسيدات، يكون المكمل الغذائي عبارة عن تركيبة غذائية كاملة، أو منتج ألبان، أو مشروب مبرد أو مشروب صالح للتخزين، أو مياه معدنية أو نقية، أو مشروب سائل، أو حساء، أو مكمل غذائي، أو بديل وجبة، أو شريط غذائي، أو حلويات، أو حليب أو منتج حليب مخمر، أو زبادي، أو مسحوق قائم على الحليب، أو منتج تغذية معوية، أو تركيبة أطفال، أو منتج غذائي للأطفال، أو منتج حبوب أو منتج قائم على حبوب مخمرة، أو آيس كريم، أو شوكولاتة، أو قهوة، أو منتج طهي مثل المايونيز أو معجون الطماطم أو صلصات السلطة أو طعام الحيوانات الأليفة. وفقًا لهذه التجسيدات، قد يتم توزيع مستخلص الاختراع في الأطعمة أو المشروبات بحيث يكون هناك تناول يومي للعناصر الغذائية النشطة بيولوجيًا، الأمر الذي يعتمد بشكل أساسي على نوع الطعام الذي يتم توزيع المستخلص فيه، والتأثير المطلوب والأنسجة المستهدفة. تعتمد كمية المكملات الغذائية التي يجب على الفرد تناولها للحصول على تأثير مفيد أيضًا على عامل أو أكثر من العوامل المختلفة مثل نوع المكمل و/أو الطعام وعمر ووزن المستهلك.

يمكن أن يكون المكمل الغذائي للإعطاء عن طريق الفم في كبسولات، أو كبسولات جيلاتينية، أو كبسولات ناعمة، أو أقراص، أو أقراص مغلفة بالسكر، أو حبوب، أو معاجين، أو أقراص استحلاب، أو صمغ، أو محاليل أو مستحلبات قابلة للشرب، أو شراب أو هلام، بجرعة تتراوح بين حوالي 0.1 إلى 100% من مستخلص الاختراع، والتي يمكن تناولها بعد ذلك مباشرة مع الماء أو بأي وسيلة أخرى معروفة. قد يحتوي هذا المكمل أيضًا على مُحلي أو مثبت أو مضاد للأكسدة أو مادة مضافة أو نكهة أو لون.

ومن المقدر أن بعض ميزات الاختراع، والتي تم وصفها من أجل الوضوح في سياق تجسيدات منفصلة، ​​يمكن أيضًا توفيرها مجتمعة في تجسيد واحد. وعلى العكس من ذلك، فإن الميزات المختلفة للاختراع، والتي تم وصفها باختصار في سياق تجسيد واحد، يمكن أيضًا توفيرها بشكل منفصل أو في أي تركيبة فرعية مناسبة أو كما هو مناسب في أي تجسيد آخر موصوف للاختراع. لا ينبغي اعتبار بعض الميزات الموضحة في سياق التجسيدات المختلفة ميزات أساسية لتلك التجسيدات، إلا إذا كان التجسيد غير فعال بدون تلك العناصر.

كما هو مستخدم هنا، فإن العملية أو المستخلص أو تركيبات الاختراع قد تتضمن خطوات أو مكونات أو أجزاء إضافية، فقط إذا كانت الخطوات أو المكونات أو الأجزاء الإضافية لا تغير الخصائص الأساسية والجديدة للعملية أو المستخلص أو التركيبات المطالب بها. كما هو مستخدم هنا، فإن الأشكال المفردة "a" و"an" و"the" تشمل مراجع الجمع ما لم ينص السياق بوضوح على خلاف ذلك.

تجد التجسيدات والجوانب المختلفة للاختراع الحالي كما هو موضح أعلاه وكما هو مطلوب في قسم المطالبات أدناه دعمًا تجريبيًا في الأمثلة التالية.

1. تجفيف عصير المارولا

تم جمع ثمار المارولا من الأرض في غضون 10 أيام من سقوط الثمار من الأشجار ثم تم عصرها بواسطة مكبس هيدروليكي تحت ضغط 35 بار (مكبس زيتون Enorossi موديل 250). تم جمع العصير وتخزينه مجمداً عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترات مختلفة تصل إلى 3 سنوات. قبل التجفيف مباشرة، تم إذابة العصير وسكبه على صواني ورق الألمنيوم، لتشكيل طبقة موحدة، سمكها 0.7 سم. تم وضع الصواني المحتوية على العصير في فرن مفرغ من الهواء (Tuttnauer، معقم فرن جاف طراز 11-900)، تم ضبطه على 57 درجة مئوية و -760 ملم زئبق، لمدة 3 أيام. بعد التجفيف، تحتوي المادة الصلبة على حوالي 1% رطوبة، ويتم طحنها للحصول على مسحوق قابل للذوبان في الماء بسهولة. تم حفظ المسحوق في مجفف، في درجة حرارة الغرفة، لعدة أشهر.

2. مستحضرات مستخلص المارولا

أ. المستخلص الإيثانولي (المشار إليه هنا باسم "المستخلص الأول")

لتحضير المستخلص الأول، تم سحق 15 جرامًا من عصير المارولا المجفف إلى مسحوق، وتم تعليقه في 50 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ ووضعه على هزاز لمدة 20 دقيقة. تم طرد المعلق ونقل السائل العلوي إلى دورق دائري. تم تكرار الخطوة مع 25 مل إضافية من الإيثانول بنسبة 50٪. تم دمج المحلولين العلويين وتم إزالة الإيثانول وبعض الماء باستخدام المبخر الدوار. كان للمحلول المائي النهائي (30 مل) سعة مضادة للأكسدة FRAP (قوة مضادة للأكسدة مخفضة للحديديك) تبلغ 1390 ملجم من مكافئ فيتامين سي لكل 100 مل (ثلاثة أضعاف سعة مضادات الأكسدة مقارنة بـ 460 ملجم من مكافئ فيتامين سي لكل 100 مل مقاسة في العصير الأصلي). يمكن إعادة تكوين المستخلص الأول في الماء.

ب. الجزء المستنفد من البوليفينول (المشار إليه هنا باسم "المستخلص الثاني"):

لتحضير المستخلص الثاني، تم تمرير عصير المارولا الكامل عبر 8 طبقات من القماش القطني وتم طرده بالطرد المركزي لإزالة حطام أنسجة الفاكهة. تم وضع 200 مل من العصير الصافي على عمود Sepabeads سعة 20 مل بمعدل تدفق 0.4 مل / دقيقة. تم جمع كسور بحجم 12 مل. تم دمج الكسور التي تحتوي على نفس تركيز المواد الصلبة الذائبة الكلية (TSS) مثل العصير الصافي (12.9٪). كان نشاط مضادات الأكسدة FRAP الذي تم قياسه في هذا الجزء 379 ملجم من فيتامين سي المكافئ لكل 100 مل، أي ما يقرب من 83% من ذلك المقاس في العصير الصافي المطبق على العمود.

ج. جزء البوليفينولي (المشار إليه هنا باسم "المستخلص الثالث").

لتحضير المستخلص الثالث، تم استخدام الاستخلاص على دفعات لتحرير البوليفينول من حبيبات العمود الموضحة أعلاه. تم نقل الخرز إلى قارورة زجاجية واسعة القاع وتم خلطها جيدا مع محلول الإيثانول بنسبة 85٪. تم استعادة المحلول الإيثانولي وتم تكرار الخطوة حتى أصبح محلول الاستخلاص عديم اللون. تم جمع المحاليل الإيثانولية المجمعة ووضعها في دورق دائري وتبخيرها حتى الجفاف باستخدام مبخر دوار. تم إذابة الفيلم الجاف في 1 مل من الماء. كان للمنتج الناتج نشاط FRAP يعادل 5735 ملجم من فيتامين سي المكافئ لكل 100 مل، وهو ما يعادل حوالي 12 ضعف النشاط المقاس في العصير الأصلي.

للحصول على مشروب المارولا الغني بالبوليفينول، تم خلط 15 مل من جزء العصير الخالي من البوليفينول (المستخلص الثاني) مع جزء البوليفينول المعزول (المستخلص الثالث)؛ تم إضافة الماء إلى الحجم النهائي البالغ 25 مل من مشروب المارولا (يشتمل على المستخلصات الموصوفة هنا II وIII) مع نشاط مضاد للأكسدة FRAP يبلغ 446 ملجم من مكافئ فيتامين سي لكل 100 مل، منها 50% ساهم بها فيتامين سي و50% بواسطة البوليفينول، مقارنة بـ ˜75% و25% على التوالي، في العصير الأصلي.

تم تحديد إجمالي البوليفينولات باستخدام طريقة مطيافية سينجلتون المعدلة لأحجام صغيرة [Singleton VL، et al، Am. [مجلة علم الأخلاق وزراعة الكروم 16: 144-158، 1965]. حمض الغاليك (GA) كان بمثابة المعيار. تم تحضير محلول GA في الماء بتركيز 2 مليمول. تم استخدام أحجام 10 و 20 و 40 و 60 ميكرولترًا للمنحنى القياسي. وتم التعبير عن النتائج بعد ذلك على أنها مكافئات GA (GAE). في بعض الأحيان، حل البيروغالول محل GA كمعيار.

3. طرق في المختبر

تين. 1  يظهر التركيز الكلي للبوليفينول في كل من عصير المارولا المفلتر، والمستخلص الإيثانولي لعصير المارولا المجفف (المستخلص الأول) والمنتج الذي تم الحصول عليه عن طريق الجمع بين المستخلصين الثاني والثالث الموصوفين هنا. وكان التركيز الإجمالي 7.15 و8.34 و9.35 ملجم من مكافئ حمض الغاليك (GAE) / مل، على التوالي.

تين. 2  يقدم كروماتوغرافيا HPLC لعصير المارولا ومستخلصات العصير. تم غسل كل مستخلص عصير (1:3) بـ 80٪ من الميثانول المضاف إليه 2 مليمولار من NaF لاستخراج مضادات الأكسدة. تم طرد المعلق بواسطة جهاز الطرد المركزي وتم ترشيح السائل العلوي من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر قبل الحقن. تم تحليل عينات بحجم 20 ميكرولترًا باستخدام نظام LaChrom Merck Hitachi HPLC، المكون من مضخة L7100، وفرن العمود L7350 (مضبوط على 28 درجة مئوية)، وخلاط مزيل الغاز L-7614 وحاقن يدوي Rheodyne، مقترنًا بكاشف الطول الموجي المتعدد (Jasco MD-2010 Plus)، والواجهة (Jasco LC-Net II / ADC) والبرمجيات العلمية (EZChrom Elite Client / Server الإصدار 3.1.6 بناء 3.1.6.2433). تم استخدام عمود Purospher®Star RP-18 ذو نهاية مغطاة (خرطوشة LichroCART® مقاس 250×4 مم، وحجم جسيمات 5 ميكرومتر) مع عمود حماية Lichrospher®100 RP-18 ذو نهاية مغطاة (خرطوشة LichroCART® مقاس 4×4 مم، وحجم جسيمات 5 ميكرومتر).

تم توصيل نهاية العمود بمجمع الكسور (Pharmacia Fine Chemicals، FRAC-100). تتكون المراحل المتحركة من (أ) حمض الفوسفوريك (0.1٪)، درجة الحموضة 2.4، و (ب) الميثانول؛ تم ضبط تدرج الامتصاص للانتقال من 0 إلى 100٪ ميثانول في 30 دقيقة. وكان معدل التدفق 0.6 مل دقيقة ^-1 .

تم تقييم تركيز فيتامين سي من المنطقة الواقعة تحت قمم الكروماتوغرام المقابلة باستخدام فيتامين سي من الدرجة HPLC (Fluka) للمعايرة. كان الميثانول من الدرجة HPLC (LiChrosolv Merck)؛ تم تنقية المياه وتصفيتها باستخدام الإجراءات المعروفة؛ كان حمض الفوسفوريك (فروتاروم) وNaF (سيجما) من الدرجة التحليلية. تم إنشاء مكتبة الفينول القياسية باستخدام الكاتيكين وحمض الكلوروجينيك وحمض الكافييك وحمض التانيك من شركة سيجما، وحمض 2-هيدروكسي بنزويك (الساليسيليك)، وكيرسيتين-3-β-جلوكوزيد وحمض الإلاجيك من شركة فلوكا.

وكما تشير مخططات كروماتوغرافيا HPLC، فإن كل مستخلص I وII وIII له تركيبة فريدة فيما يتعلق بالمركبات الفينولية [الأحماض الفينولية (PA) والعفص (T)] وفيتامين C. وقد اختلفت المستخلصات الثلاثة بشكل كبير في تركيبتها المضادة للأكسدة مقارنة بالعصير الأصلي.

تم أيضًا تحليل قدرة منتجات عصير المارولا على إزالة الجذور الحرة بواسطة اختبار DPPH [Malterud KM، Farbort TL، Huse ACE، Bredo Sund R. تأثيرات مضادات الأكسدة وإزالة الجذور الحرة للأرثراكينون والأنثورون. علم الأدوية. [1993: 47: 77-85]. DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) عبارة عن مادة مولدة للجذور الحرة تُستخدم على نطاق واسع لمراقبة قدرات إزالة الجذور الحرة (قدرة المركب على التبرع بإلكترون) لمضادات الأكسدة المختلفة. يتمتع الجذر DPPH بلون بنفسجي عميق بسبب الإلكترون المتضرر، ويمكن متابعة إزالة الجذر باستخدام مطياف ضوئي عن طريق فقدان الامتصاص عند 517 نانومتر، حيث يتم إنتاج الشكل غير الجذري ذو اللون الأصفر الباهت.

تم خلط أجزاء صغيرة من منتج عصير المارولا (1.0 ميكرولتر) مع 1 مل من 0.1 مليمول DPPH / لتر في الإيثانول، وتم مراقبة التغير في الكثافة البصرية عند 517 نانومتر بشكل مستمر. تمت مقارنة قدرة مستخلصات عصير المارولا على إزالة الجذور الحرة بقدرة عصير المارولا المصفى على إزالة الجذور الحرة ( تين. 3أ و 3ب ).

عند تركيز 1.0 ميكرولتر/مل، أدى عصير المارولا المفلتر إلى انخفاض بنسبة 30% في الكثافة البصرية عند 517 نانومتر، في حين أدى المنتج الذي تم الحصول عليه عن طريق الجمع بين المستخلصات II وIII الموصوفة هنا (على سبيل المثال، عصير المارولا المخصب بمستويات عالية من البوليفينول) إلى انخفاض بنسبة 21% في الكثافة البصرية عند 517 نانومتر. تم إظهار قدرة إزالة الجذور الحرة الأكثر بروزًا بواسطة المستخلص الأول، والذي أدى إلى انخفاض بنسبة 54٪ في الكثافة البصرية عند 517 نانومتر ( تين. 3أ ). عند تركيزات أعلى (2.0 ميكرولتر / مل)، أدى عصير المارولا المفلتر والمطرود إلى انخفاض بنسبة 60٪ في الكثافة البصرية عند 517 نانومتر. وبالمثل، أدى المنتج الذي تم الحصول عليه عن طريق الجمع بين المستخلصين الثاني والثالث الموصوفين هنا إلى انخفاض بنسبة 43% في الكثافة البصرية عند 517 نانومتر، كما أظهرت المستخلص الأول مرة أخرى قدرة ملحوظة على إزالة الجذور الحرة، مما أدى إلى انخفاض بنسبة 89% في الكثافة البصرية عند 517 نانومتر ( تين. 3ب ).

تم عزل البروتين الدهني منخفض الكثافة من البلازما المشتقة من متطوعين أصحاء ذوي مستوى دهني طبيعي، عن طريق الطرد المركزي الفائق لتدرج الكثافة المتقطع [Aviram, M. (1983) فصل البروتين الدهني في البلازما عن طريق الطرد المركزي الفائق لتدرج الكثافة المتقطع في مرضى فرط البروتين الدهني. الكيمياء الحيوية. ميد. [30، 111-118]. تم غسل LDL عند d=1.063 جم/مل، وتم غسيله باستخدام 150 مليمول/لتر كلوريد الصوديوم، 1 مليمول/لتر EDTA من Na ₂ (درجة الحموضة 7.4) عند 4 درجات مئوية. ثم تم تعقيم LDL بالترشيح (0.45 ميكرومول)، وحفظه تحت النيتروجين في الظلام عند 4 درجات مئوية واستخدامه في غضون أسبوعين. تم تحديد تركيز بروتين LDL باستخدام كاشف Folin Phenol. قبل الأكسدة، تم غسيل LDL باستخدام محلول ملحي فوسفاتي منظم (PBS) خالٍ من EDTA، بدرجة حموضة 7.4، ودرجة حرارة 4 درجات مئوية.

تم تحضين LDL (100 ميكروغرام من البروتين / مل) لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة مع زيادة تركيزات مستخلصات عصير المارولا. ثم 5 ميكرومول/لتر من _CuSO4 تم إضافة وحضن الأنابيب لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، تم تحديد مدى أكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة عن طريق قياس الكمية الناتجة من المواد التفاعلية مع حمض الثيوباربيتيوريك (TBARS) وبيروكسيدات الدهون [Aviram M، Vaya J. علامات أكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة. طرق انزيمول. 2001؛ 335: 244-56؛ وBuege JA، Aust SD بيروكسيد الدهون الميكروسومي. طرق انزيمول. 52: 302-310 (1978)]. يقوم اختبار بيروكسيد الدهون (PD) بتحليل تكوين بيروكسيد الدهون من خلال قدرتها على تحويل اليوديد إلى يود بعد الحضانة لمدة 18 ساعة عند 25 درجة مئوية، كما تم قياسها باستخدام مطياف ضوئي عند 365 نانومتر [G. يورغنز. اختبار طيفي فوتومتري لبيروكسيدات الدهون في البروتينات الدهنية في المصل باستخدام كاشف متوفر تجاريا. مجلة بحوث الدهون 30: 627-630، 1986].

تم قياس أكسدة LDL من خلال TBARS ( تين. 4أ ) أو كتكوين بيروكسيدات الدهون ( تين. 4ب ). أدى إضافة تركيزات متزايدة من مستخلصات عصير المارولا إلى تثبيط أكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة الناجم عن أيونات النحاس بطريقة تعتمد على الجرعة. IC ₅₀ (تثبيط أكسدة LDL بنسبة 50٪) كانت قيمة عصير المارولا المصفى والمطرود مركزيًا 0.80 ميكرولتر / مل لـ TBARS ( تين. 5أ ) و 0.65 ميكرولتر/مل لبيروكسيدات الدهون ( تين. 5ب ) تشكيل. تم الحصول على نتائج أقل إلى حد ما للمستخلص الأول (0.50 ميكرولتر / مل لكل من TBARS وتكوين بيروكسيدات الدهون). على العكس من ذلك، فإن IC ₅₀ كانت القيمة للمنتج الذي تم الحصول عليه عن طريق الجمع بين المستخلصات II وIII الموصوفة هنا هي الأعلى (1.35 و1.50 لـ TBARS ولبيروكسيدات الدهون، على التوالي).

تم تحضين الخلايا البلعمية J-774A.1 مسبقًا مع 10 و 30 ميكروجرام من مكافئات GAE / مل من منتجات عصير المارولا، ثم تم تحليل الخلايا لمعرفة قدرتها على تصلب الشرايين، والتي تم تقييمها من خلال حالة أكسدة الخلايا البلعمية، وامتصاص الخلايا البلعمية للبروتينات الدهنية، وتدفق الكوليسترول بوساطة HDL، وتخليق الكوليسترول.

تم تحديد الحالة التأكسدية للبلعميات عن طريق اختبار التدفق الخلوي باستخدام ثنائي كلوروفلوريسين- ثنائي الأسيتات (DCFH-DA). DCFH-DA هي صبغة غير قطبية تنتشر في الخلايا. في الخلايا يتم تحلله إلى المشتق غير الفلوري 2',7'-ديكلوروفلوريسين (DCFH)، وهو قطبي ومحاصر داخل الخلايا. تحت الضغط التأكسدي، يتأكسد DCFH إلى DCF، وهو مركب فلوري. تم تحضين الخلايا البلعمية J774 A.1 (2×10 ⁶ ) مع 2.5×10 ⁻⁵ مول/ل DCFH-DA لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم إيقاف التفاعل عن طريق الغسيل باستخدام PBS عند 4 درجات مئوية. تم تحديد الفلورسنت الخلوي باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي (FACS-SCAN، Becton Dickinson، San Jose، Calif.، USA). تم إجراء القياسات عند 510 إلى 540 نانومتر بعد إثارة الخلايا عند 488 نانومتر باستخدام ليزر أيون الأرجون.

أدى حضانة الخلايا البلعمية J-774 A.1 لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع المستخلص الأول وعصير المارولا المفلتر إلى انخفاض الإجهاد التأكسدي الخلوي، كما تم قياسه بواسطة اختبار DCFH، بنسبة 6% و7% على التوالي. لم يكن للمنتج الذي تم الحصول عليه عن طريق الجمع بين المستخلصات II وIII الموصوفة هنا أي تأثير على حالة الإجهاد التأكسدي للبلعميات ( تين. 6 ).

تم حضن LDL (1 ملغ / مل) لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5 ميكرومول / لتر من _CuSO4 المحضر حديثًا. تم إنهاء الأكسدة بالتبريد عند 4 درجات مئوية. تم تحديد مدى أكسدة LDL بواسطة اختبار TBARS.

تم ربط LDL وOx-LDL بالفلوروإيزوثيوسيانات (FITC) لدراسات الامتصاص الخلوي. تم غسيل البروتينات الدهنية (2.5 ملغ بروتين / مل) طوال الليل عند 4 درجات مئوية مقابل عدة تغييرات في محلول بورات يحتوي على 0.1 مول بورات، 25 ملي مول رباعي بورات الصوديوم، 75 ملي مول كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة 8.6. قبل الاقتران (1 ساعة)، تم تغيير الرقم الهيدروجيني لمحلول الغسيل الكلوي إلى 9.4. تم إذابة إيزوثيوسيانات الفلوريسين (FITC؛ Sigma-Aldrich) في ثنائي ميثيل فورماميد (Merck) وإضافته قطرة قطرة إلى محلول البروتين الدهني لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 0.2 مجم/مل ثم تم حضنه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك. تم فصل البروتينات الدهنية المرتبطة بـ FITC عن FITC غير المرتبطة عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم على عمود PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech)، وتم غسلها بمحلول فوسفات 10 مليمول، درجة حموضة 8.0. تم استخدام البروتينات الدهنية الموسومة بـ FITC (2 ملغ / مل) على الفور في دراسات الامتصاص.

تم حضانة الخلايا البلعمية J774 A.1 عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات مع LDL المقترن بـ FITC أو Ox-LDL بتركيز نهائي يبلغ 25 ميكروجرام من البروتين / مل. تم تحديد امتصاص البروتين الدهني عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم إجراء قياسات الفلورسنت الخلوي المحددة بواسطة FACS عند 510 نانومتر إلى 540 نانومتر بعد إثارة الخلايا عند 488 نانومتر باستخدام ليزر أيون الأرجون. تم قياس الفلورسنت الخلوي من حيث شدة الفلورسنت المتوسطة (MFI).

لم يكن لحضانة الخلايا البلعمية J-774 A.1 لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع منتجات عصير المارولا (10 ميكروجرام / مل GAE) أي تأثير على امتصاص LDL بواسطة الخلايا البلعمية. عند تركيز أعلى يبلغ 30 ميكروجرام/مل من GAE، فإن المنتج الذي يشتمل على المستخلصات II وIII الموصوفة هنا فقط يقلل من امتصاص LDL في الخلايا البلعمية بنسبة 9% ( تين. 7 ). أدى حضانة الخلايا البلعمية J-774 A.1 لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع المستخلص الأول، وهو منتج تم الحصول عليه عن طريق الجمع بين المستخلصين الثاني والثالث الموصوفين هنا وعصير المارولا المصفى، إما عند 10 ميكروجرام/مل GAE أو 30 ميكروجرام/مل GAE، إلى تقليل امتصاص الخلايا البلعمية لـ Ox-LDL بنسبة 12% و7% (المستخلص الأول)، وبنسبة 27% (عصير المارولا ذو المحتوى العالي من البوليفينول)، وبنسبة 8% و6% (عصير المارولا المصفى)، على التوالي ( تين. 8 ).

تم حضانة الخلايا البلعمية J774 A.1 مع الكوليسترول المُوسوم بـ [ ^3H ] (2 μCi/mL) لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية، يليه غسل ​​الخلايا في PBS المثلج (×3) ثم حضانة أخرى في غياب أو وجود 100 ميكروجرام من بروتين HDL/مل لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية. تم تحديد كمية العلامات الخلوية والوسطية [ ^3H ] وتم حساب تدفق الكوليسترول بوساطة HDL كنسبة العلامة [ ^3H ] في الوسط / (العلامة [ ^3H ] في الوسط + العلامة [ ^3H ] في الخلايا). أدى حضانة الخلايا البلعمية J-774 A.1 لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع عصير المارولا المفلتر (10 ميكروجرام/مل GAE) إلى زيادة تدفق الكوليسترول من الخلايا البلعمية إلى HDL بنسبة ˜10%. ومع ذلك، فإن جميع منتجات عصير المارولا الأخرى لم تؤثر على تدفق الكوليسترول بوساطة البروتين الدهني عالي الكثافة عند أي تركيز مستخدم ( تين. 9 ).

تم تحضين الخلايا البلعمية J774 A.1 مع أسيتات [ ^3H ]، متبوعًا باستخراج الدهون الخلوية باستخدام الهكسان: الأيزوبروبانول (3:2، حجم/حجم) والفصل بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) على ألواح هلام السيليكا. تم تصوير بقع الكوليسترول غير المؤستر بواسطة بخار اليود، وكشطها في قوارير الوميض، وحسابها من حيث النشاط الإشعاعي. أدى حضانة الخلايا البلعمية J-774 A.1 لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع المستخلص الأول، وهو منتج تم الحصول عليه عن طريق الجمع بين المستخلصين الثاني والثالث الموصوفين هنا وعصير المارولا بعد الترشيح، كل ذلك بتركيز 30 ميكروجرام/مل GAE، إلى تقليل تخليق الكوليسترول في الخلايا البلعمية بنسبة 18% و7% و8% على التوالي ( تين. 10 ).

تم الحصول على فئران ويستار حديثة الولادة من مختبرات هارلان. تم تحضير ثقافات الخلايا النجمية الأولية للجرذان من قشور المخ لجرذان ويستار حديثة الولادة بعمر 1-2 يوم. تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة رعاية الحيوان والاستخدام المؤسسي. تم زرع الخلايا النجمية في صفيحة ذات 24 بئرًا بمعدل 100000 أو 80000 خلية / 0.5 مل / بئر، على التوالي. تم إجراء جميع التجارب في وجود 2٪ مصل (FCS). تم شفط الوسط الأصلي للخلايا وتم إضافة وسط جديد إلى الخلايا. _{تخفيفات H2O2} وتم تحضير عصائر المارولا والعنب في وسط النمو طازجة من المحاليل المخزنة قبل كل تجربة مباشرة وتم استخدامها على الفور. تم إجراء كل معاملة في رباعيات. التركيز النهائي لـ H ₂ O ₂ كان 200 ميكرومتر.

تجارب زراعة الخلايا العصبية

تحديد قابلية الخلايا للبقاء على قيد الحياة - تم تحديد قابلية الخلايا للبقاء على قيد الحياة باستخدام مجموعة اختبار لونية تجارية (مقدمة من شركة Roche)، استنادًا إلى قياس نشاط لاكتات ديهيدروجينيز (LDH) المنطلق من السيتوزول للخلايا التالفة في السائل العلوي.

التأثيرات الوقائية للمستخلصات - لتحديد الظروف المثلى (من حيث الوقت والجرعة) للعصائر لممارسة تأثيرها الوقائي المفترض، تمت معالجة الخلايا مسبقًا بكميات مختلفة من كل منتج عصير لفترات زمنية مختلفة وتم تحديد التأثيرات الوقائية للمنتجات ضد الإجهاد التأكسدي الناتج عن H ₂ O ₂ تم تقييمها. تمت إضافة العصائر (بتخفيف 1:125، 1:500، 1:800 و1:4000) بشكل متزامن مع H ₂ O ₂ أو تم حضنها مسبقًا لمدة ساعتين مع الخلايا قبل إضافتها. وتم رصد السمية بعد مرور 20 ساعة. تين. 11  يُظهر أنه في جميع التركيزات التي تم اختبارها ولجميع منتجات العصير، فإن الإضافة المصاحبة للعصائر مع H ₂ O ₂ ليس وقائيا. ومع ذلك، فإن الحضانة المسبقة لمدة ساعتين مع الخلايا قبل إضافة الماء H ₂ O ₂ وقد أدت الإضافة إلى ظهور تأثيرات وقائية لجميع العصائر، حيث أظهر المستخلص الأول النشاط الوقائي الأكثر فعالية عند استخدامه بتركيزات منخفضة (1:4000).

التجارب التي أجريت على مستخلصات المارولا بتركيزات منخفضة (تخفيفات 1:1000-1:8000) - تم إجراء التجارب التالية بتركيزات أقل من المنتجات (تخفيفات 1:1000-1:8000)، أي ما يعادل ˜55-450 ميكروجرام/100 مل من فيتامين سي.

تم اختبار تأثير فترة ما قبل الحضانة (2 ساعة مقابل 6 ساعات) للخلايا مع منتجات العصير وتركيز المنتج (1: 1000-1: 8000). تين. 12  يُظهر أنه في حين أن ساعتين من الحضانة المسبقة بالمستخلص الأول تسببت فقط في حماية بنسبة 20% في جميع التركيزات التي تم اختبارها، فإن 6 ساعات من الحضانة المسبقة أسفرت عن حماية تزيد عن 80%.

وفي تجربة أخرى، تم اختبار تأثير وقت الحضانة والتركيز بتخفيفين (1:1000 أو 1:4000) لكل عصير، عصير المارولا المصفى والمستخلص الأول، لمدة 2 أو 6 ساعات _قبل إضافة _H2O2 ( تين. 13 ). لقد وجد أن المستخلص الأول هو الأكثر فعالية (حماية بنسبة 70%). وأظهر عصير المارولا المفلتر أيضًا نشاطًا وقائيًا كبيرًا (حماية بنسبة 40%).

4. البروتوكول السريري

تم تجنيد عشرة متطوعين أصحاء (الجدول 1)، غير مدخنين، ولا يعانون من اضطرابات التمثيل الغذائي، ومستويات الكوليسترول في البلازما أقل من 200 ملغ / ديسيلتر ولا يتلقون أي علاج دوائي، للدراسة. قام جميع المشاركين بالتوقيع على نموذج الموافقة قبل الدخول في الدراسة. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة رامبام هلسنكي (رقم 2452).

تناول جميع المشاركين 200 مل من العصير المبستر يوميًا، مع وجبتهم الرئيسية، لمدة 3 أسابيع. واستمر جميع المشاركين في الدراسة في نمط حياتهم المعتاد. تم قياس ضغط الدم في وقت الصفر (قبل دخول الدراسة)، وبعد 3 أسابيع، وفي نهاية الدراسة (بعد 4 أسابيع من الغسيل). تم جمع عينات الدم (25 مل) للتحليل في الوقت صفر (الأساس - قبل دخول الدراسة)، بعد 3 أسابيع من استهلاك عصير المارولا، و 4 أسابيع بعد انتهاء استهلاك العصير (الغسيل).

تم تجميد جميع عينات مصل الدم عند درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى التحليل. تم إجراء التحاليل الكيميائية الحيوية في المصل باستخدام مجموعات التشخيص المتوفرة تجاريا، وشملت قياس الجلوكوز والكالسيوم ووظائف الكلى (BUN والكرياتينين وشوارد الصوديوم والبوتاسيوم) ووظائف الكبد (CK وAST والبيليروبين الكلي) والكوليسترول الكلي وكوليسترول HDL وكوليسترول LDL والدهون الثلاثية الكلية. تم قياس مستويات حمض البوليك (كمضاد للأكسدة محتمل) في المصل باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا.

تحليل الإجهاد التأكسدي لعينات المصل

قوة مضادات الأكسدة المختزلة للحديديك (FRAP): تم تحضير كاشف FRAP العامل عن طريق خلط 25 مل من محلول أسيتات، و2.5 مل من محلول 2,4,6-تريبيريديل-إس-تريازين (TPTZ)، و2.5 مل من محلول FeCL ₃ *6H ₂ O. تم استخدام المحاليل المائية لـ 1 مليمول _FeSO4 * _7H2O بتركيزات 5، 10، 20، 30، 40، 50 و 100 مليمول لمنحنى المعايرة القياسي. تم تسخين كاشف FRAP (المُحضّر حديثًا) إلى 37 درجة مئوية وتم قراءة عينة من الكاشف عند 593 نانومتر باستخدام مطياف ضوئي. تم خلط عينة المصل (30 ميكرولتر) مع 90 ميكرولتر من الماء. ثم تمت إضافة 900 ميكرولتر من كاشف FRAP وتم خلطها بسرعة. تمت قراءة الامتصاصية بعد 0.5 ثانية وكل 15 ثانية لمدة 4 دقائق. تم حساب التغير في الامتصاص (A _{593 نانومتر} ) بين الكثافة البصرية النهائية والأولية لكل عينة ثم تم ربطه بـ Fe ⁺² التركيز في المنحنى القياسي (تم اختباره بالتوازي).

أكسدة الدهون في المصل

تم تخفيف المصل بنسبة 1:4 (حجم: حجم) باستخدام محلول ملحي فوسفاتي منظم (PBS) ثم تم تحضينه في غياب أو وجود 100 مليمول / لتر من مولد الجذور الحرة 2،2'-آزوبيس-2-أميدينوبروبانول هيدروكلوريد (AAPH) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. تم تحديد بيروكسيد الدهون في المصل عن طريق قياس الكمية الناتجة من المواد التفاعلية مع حمض الثيوباربيتيوريك (TBARS) وبيروكسيدات الدهون باستخدام طرق قياس الطيف الضوئي. يقوم اختبار بيروكسيد الدهون (PD) بتحليل تكوين بيروكسيد الدهون من خلال قدرتها على تحويل اليوديد إلى يود بعد الحضانة لمدة 18 ساعة عند 25 درجة مئوية، كما تم قياسها باستخدام مطياف ضوئي عند 365 نانومتر.

وكما تشير نتائج الدراسة، فإن الاستهلاك لم يكن له تأثير كبير على ضغط الدم؛ ولم تتغير مستويات الجلوكوز والكالسيوم في المصل بشكل كبير بعد الاستهلاك، ولم تتأثر اختبارات وظائف الكلى بشكل كبير بالاستهلاك المستمر. وعلى نحو مماثل، أدى الاستهلاك إلى ثبات مستويات الإلكتروليت في الدم ووظائف الكبد إلى حد كبير. ومع ذلك، انخفضت مستويات الدهون الثلاثية في المصل بنسبة 7% بعد الاستهلاك، مع استمرار التأثير بعد فترة الغسل التي استمرت 4 أسابيع (الجدول 2).

وقد أدى الاستهلاك على مدى فترة 3 أسابيع إلى انخفاض تركيزات الكوليسترول الكلي في المصل بنسبة 8٪ بشكل ملحوظ (p <0.02) (الجدول 3).

وقد يكون هذا الانخفاض مرتبطًا بانخفاض كبير (p<0.01) في مستويات الكوليسترول الضار LDL بنسبة 17%. ومع ذلك، لم تستمر هذه الانخفاضات بعد فترة الغسيل، حيث عادت مستويات الكوليسترول الكلي، وكذلك مستويات الكوليسترول الضار، إلى مستوياتها الأساسية بعد 4 أسابيع من فترة الغسيل، والتي لم يستهلك فيها الشخص العصير. ارتفع مستوى الكوليسترول الحميد في المصل بشكل ملحوظ (p<0.03) بنسبة 10٪ بعد تناول العصير واستمر هذا الانخفاض، وإن كان بدرجة أقل (7٪ فقط)، بعد فترة الغسيل.

يوضح الجدول 4 التأثير على الإجهاد التأكسدي في المصل. تم إخضاع عينات المصل للأكسدة الناجمة عن AAPH. انخفض تكوين بيروكسيد الدهون بشكل ملحوظ (p<0.03) في عينات المصل المأخوذة بعد الاستهلاك لمدة 3 أسابيع. ومع ذلك، لم يستمر هذا التأثير بعد فترة الغسيل. وفي عينات المصل المأخوذة بعد الاستهلاك، زادت "القوة المضادة للأكسدة"، التي تم قياسها بواسطة اختبار FRAP، خلال فترة الاستهلاك، وزادت أكثر من ذلك، لتصل إلى ارتفاع كبير بنسبة 8% بعد فترة الغسيل. قد يكون الانخفاض في الإجهاد التأكسدي في المصل نتيجة لانخفاض تركيزات الدهون في المصل (قلة الركيزة المتاحة للأكسدة، بالإضافة إلى تأثير مضادات الأكسدة القوية في عصير المارولا).

تم تلخيص تأثير استهلاك العصير المبستر على الإجهاد التأكسدي في المصل في تين. 14أ-ب . تم إخضاع عينات المصل للأكسدة الناجمة عن AAPH. تكوين بيروكسيد الدهون ( تين. 14أ ) انخفضت بشكل ملحوظ (p<0.03) في عينات المصل المشتقة بعد استهلاك العصير على مدى فترة 3 أسابيع. ولم يستمر هذا التأثير بعد فترة الغسيل. قدرة مضادات الأكسدة، التي تم قياسها بواسطة اختبار FRAP ( تين. 14ب )، زادت في عينات المصل المشتقة بعد استهلاك عصير المارولا المبستر، والمثير للدهشة أنها زادت بشكل أكبر، لتصل إلى ارتفاع كبير بنسبة 8٪، بعد فترة الغسيل.